第三节
支原体合成生物学

支原体合成生物学的本质是合成基因组学。该研究主要由J. Craig Venter团队开展，历时21年，最终达到可以对支原体的全基因组进行设计、合成并组装成新生命的水平。“人造生命”的实现主要通过四个步骤：①实现天然支原体染色体向原生质体的移植。②化学合成支原体的全基因组（人工染色体）。③人工染色体控制细胞的生命特征。④人为地设计、合成基因组，从而组装成新的支原体细胞。其中最大的技术瓶颈在第二步，难点在于合成的小片段基因如何整合成一个完整的染色体基因组。早在2002年，Eckard Wimmer团队合成了世界上第一个人造病毒。2010年，Venter团队合成了第一个具备生长和繁殖能力的原核生物——支原体“辛西娅”。2018年，最小的真核模式生物——酵母也由中美科学家完成了人工合成。合成生物学的出现与发展，表明自然界的遗传规律可以被人为打破，人工可以干预复杂的生命体系。合成生物学最终极的目标是：明确维持基本生命特征的核心基因群，解码每个基因的作用，通过设计和改造，直接创造出表型与人们意愿一致的目标生命。合成基因组学对人类的生存产生并将继续产生深远影响，包括新化学和能源的产生、人类健康和医学的进步、清洁水和食品的生产、对环境的积极影响，甚至可能对我们的进化产生影响。

一、最小基因组的概念

支原体是从复杂的细菌通过减少在感染宿主时非必需的基因和功能进化而来。最小细胞的概念是20世纪50年代由Harold Morowitz和他的同事提出，他们的研究很快聚焦于物理大小和基因组大小均最小的生殖支原体（约577kb）。随着测序技术的发展，最小基因组的概念被提出，它是指能够使生物生长和繁殖所必需的最少数目的基因。各种理论和实验手段都被用于最小基因组的研究。通过比较基因组学的方法，可以找出一群所有物种基因组所共有的同源基因家族，这些基因（家族）给出了最小基因组的一个近似范围。但是有些基因的保守功能由非直系同源基因来执行，这样就需要实验手段来进一步验证。通过转座子Tn4001引入随机突变，如果基因突变后依然可以存活下来，表明突变的基因为非必需基因，不属于最小基因组的范畴。支原体的最小基因组最先是由Mushegian和Koonin在生殖支原体提出，通过多种方法，推测有265～350个基因组成了生殖支原体的最小基因组。由于生殖支原体的基因组最小，所以一开始被作为研究合成生物学的最佳物种。但是由于其生长速度较慢，被基因组大小为1 080kb的蕈状支原体所代替。支原体最小基因组的范畴也由于合成生物学的发展进一步精确与缩小。

二、基因组在细菌间的移植：从一个物种变到另一个物种

合成生命的第一步是实现外源基因组可以在细菌原生质体中存活，并且生长和繁殖。2007年，Venter团队通过移植染色体技术完成了山羊支原体向蕈状支原体的转化。具体过程是把蕈状支原体的几乎不带蛋白的完整基因组DNA通过聚乙二醇的方法移植到山羊支原体中。通过四环素抗性进行筛选带有蕈状支原体遗传物质的山羊支原体。通过测序鉴定，发现新组成的细胞含有供体蕈状支原体的全部基因组，并且完全检测不到受体细胞山羊支原体的基因组序列。通过表型鉴定发现，新细胞几乎完全具备了蕈状支原体的生物学特性。

三、人工染色体的化学合成、组装和控制新生命

支原体染色体的化学合成最先是2008年在生殖支原体上完成的。完全化学合成了582 970对碱基的生殖支原体基因组，除了毒力基因 MG408 被插入的抗生素标记基因所破坏外，它包含生殖支原体G37株野生型的所有基因。为了区分这个人工染色体，转座子插入位点人为地添加了“水纹”。这个580kb的人工染色体是分5个步骤完成的，5～7kb大小的合成核苷酸片段通过大肠埃希菌BAC同源重组的方式形成24kb、72kb（1/8基因组）和144kb（1/4基因组）的片段。4个144kb基因组在测序完全正确后，通过酵母系统进行同源重组，形成完整的生殖支原体染色体。最后获得了一个测序完全正确的克隆，命名为JCVI-1.0（图4-1）。随后，染色体的人工合成方法又获得了拓展。可以通过“一步法”在酵母中获得生殖支原体的全基因组染色体，它是由覆盖生殖支原体全基因组的25个DNA片段重组而来。由于生殖支原体的生长速度缓慢，之后的研究主要集中到生长迅速、基因组大小中等的蕈状支原体。蕈状支原体人工染色体的构建方法是：首先把携带包含酵母着丝粒的复制原件插入到克隆的蕈状支原体基因组，然后转染酵母，经过酵母的基因操作系统修饰后转入山羊支原体的原生质体，这样使得蕈状支原体的染色体不会被山羊支原体的原生质体中的一些工具修饰和改变。这些技术为大分子DNA的人工合成提供了方法，同时也为人工合成天然DNA片段和人为设计DNA片段杂合体提供方法。2010年，综合上述3种方法的经验，Venter团队人工合成和组装了1.08Mb的蕈状支原体基因组。把这个染色体移入山羊支原体的原生质体后，形成能够生长和繁殖的支原体。这个新生命的基因型和表型与蕈状支原体几乎完全一致。这标志着“人造生命”的正式成功。

四、设计和合成生命

人工合成支原体的成功和最小基因组的提出，提示在此基础上，还可以通过基因组设计和人工合成的方法，创造一个比任何天然生命都小的人工细胞。通过该方法可最小化一个细胞的基因组借此来鉴定维持生命的最小基因组。在设计JCVI-syn2.0的时候，仅依赖分子生物学知识和有限的转座突变数据来合成基因组时，并没有获得可以存活的细胞。因为除了必需和非必需基因外，还有许多半-必需基因，这些基因可能对细胞的存活不是绝对重要的，但是他们的存在却是细胞强劲生长所必需的。通过改良的转座子突变方法进行筛选，可以确定更多基因独立的分子和生物学功能。基于这种方法的筛选及后期的设计，以蕈状支原体基因组为模板合成了JCVI-syn3.0，它包含蕈状支原体完整基因组不到一半的基因，约531kb，编码473个基因。这些基因中保留了半-必需基因，其中79个基因没有明确的功能归类，其余的主要分为4大功能类：①基因的表达（195个基因）；②基因组信息的维持（34个基因）；③细胞膜的结构和功能（84个基因）；④胞质内代谢（81个基因）。在从JCVI-syn1.0到JCVI-syn3.0的过程中，发现基因组的大小和细胞的生长速率存在制约关系。JCVI-syn3.0是目前可以使细胞存活的最小基因组。但是JCVI-syn3.0的生长速率是JCVI-syn1.0的1/3（图4-2）。然而，它依然保留了相当数目的未知功能基因，提示在基因组中还存在未发现的对维持生命至关重要的功能。因此，JCVI-syn3.0可以作为一个为研究生命核心功能的重要平台，该技术也为在基因组层面大范围编辑提供可能。

（陈蓉　冯志新） GHKISnmghR46AL0uubyGP178QnihdvlFB4rlQ5v/s5wECJueh//68sb4ZFwpQdPi