第4章
基因组测序，启航

“我的想象似流萤，流光点点，在黑暗中闪烁着光明。”

——泰戈尔

“酒醉之话，清醒时要践行。这会让你学会闭嘴。”

——欧内斯特·海明威

这家将会彻底改变人类基因组测序的英国公司，起源于一家英国酒馆，当时其创始人喝了几品脱 温啤酒，考虑到英国盛行的酒吧文化，这似乎也是情理之中的事。 ^[1] 1997年夏天，英国剑桥大学的潘顿酒吧举办了一系列“啤酒峰会”。尚卡尔·巴拉苏拉曼尼安和戴维·克兰曼都是剑桥大学化学系的初级教员，他们经自己带的博士后马克·奥斯本和科林·巴恩斯介绍来到了这家酒吧。他们一边喝着当地的啤酒，一边讨论如何利用激光照射荧光标记的核苷酸，来观察DNA聚合酶是怎样合成固定在表面的单个DNA分子的。就是在这里，基因组测序领域的一项关键技术取得了突破性进展，将主导“下一代”人类基因组测序的全球格局。

克兰曼的实验室里有一套激光系统，这促成了他与核酸化学家巴拉苏拉曼尼安的首次会面。讨论合作事宜时，他们发现彼此都对DNA的合成感兴趣。他们讨论了追踪DNA运动的方法，预感到这可能会带来一种更快捷的DNA测序方法。尽管嘴上说只是“随便玩玩”，但其实他们非常认真投入，他们与阿宾沃斯风险投资公司接洽，由其注资成立了一家公司，承诺将DNA测序通量提高10倍至10万倍。后来这家公司被命名为索莱科萨（Solexa），该词源自“Sol”，这个词的意思是光，也暗指单分子。 这家公司在剑桥大学附近建立了第一个实验室。实验室的硬件条件比大学好很多，但距离其成为基因组革命引擎还有很长的路要走。

此时克莱夫·布朗登场了，他注定要成为基因组革命的推动者，以及后来的基因组革命的颠覆者。 起初克莱夫对索莱科萨公司并没有太深的印象，但听说过这家公司的相关人员和理念，感觉还不错。但去参加工作面试时，他心里一沉。原因出在公司的建筑上。回想起2001年参加面试时的情景，他对我说：“那栋楼基本上就是一个挂着牌子的棚子。”但是，一走进去他就喜欢上了这个团队（公司创始人当时已经把“火炬”传给了首席执行官尼克·麦库克、哈罗德·斯维德洛和约翰·米尔顿）。团队的其他成员似乎也很喜欢克莱夫，所以他入伙了。

克莱夫在英格兰西北部的布莱克本长大，一直对计算机很痴迷，9岁时学会了在视频精灵机器上编程，12岁时就可以在Dragon 32电脑上编程。高中时他就对DNA很感兴趣，所以读大学时选择了遗传学专业。后来他发现自己对整个大学生活没有一点儿兴趣（他的原话是“无聊透顶”），于是到一家制药公司去实习，他觉得这更刺激。大学毕业后，他搬到苏格兰的格拉斯哥市，考虑攻读博士学位，但他对学术界的态度仍然很矛盾，因此转而攻读计算机科学的硕士学位。他也由此来到了剑桥著名的桑格基因测序中心，师从理查德·德宾和戴维·本特利。桑格基因测序中心正是在这两位导师的带领下完成了人类基因组计划近三分之一的测序工作，使该中心成为最大的贡献者。“所以，这使我成为一名生物信息学家。”克莱夫像往常一样轻描淡写地回忆道（至少在和个人成就有关的事情上，他表现得很谦虚）。在索莱科萨公司，他对激光照射这项技术怀有很高期待，不过最开始，他对真正的机器仍将信将疑。“我的意思是，这台机器实际上没什么用，”他回忆起早期在索莱科萨新实验室的日子时这样说道，“它们能够效仿尚卡尔和戴维（在大学里）所做的事。基本上就是，往碱基上加一些荧光，得到一些DNA，然后查看光斑。”

这样做主要是为了观察DNA的生成。腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶这四种构成DNA的碱基被提供给DNA聚合酶这一复制机器，以便其对粘在玻璃片上的DNA片段进行复制。这些碱基被改造成装有微型荧光灯泡的物质，然后，测序仪使用激光来打开灯泡，并用显微镜来“读取”DNA模板中每个位点上的碱基。每一个模板上可能有数百万个位点，这可以极大地扩大测序规模。但当前的挑战在于单个碱基的荧光都不是很亮，他们需要想办法来提高光源的亮度。

然而，该公司有更远大的目标：他们想对整个人类基因组进行测序。为此，他们必须从更宏观的角度来思考问题，尤其应该看到整个美国市场。于是他们开始寻找新的首席执行官。

约翰·韦斯特早就听说DNA将成为一个“大事件”。 他出生于密歇根州的底特律，父亲在福特汽车公司工作。约翰在麻省理工学院攻读工程学学士和硕士学位时，建立了一个用于组装半导体的机器人系统，后来加入了一家名为伯乐（BioRad）的公司，负责领导研发团队。早期的桑格基因测序用机器放射自显影并从测序凝胶上读取放射性DNA序列，伯乐公司已经实现了显影胶片读取的自动化。约翰记得，虽然当时实现对人类整个基因组测序这一想法的可能性很小，但他仍觉得这是一件令人梦寐以求的事情。约翰喜欢将工程创新投入商业领域，他在沃顿商学院攻读了MBA学位，然后加入并领导了普林斯顿仪器公司，这家公司生产的照相机能捕捉到亮度非常低的光。1998年，这款照相机的首批客户中，有一家名为索莱科萨的英国小公司。

2004年，约翰在应用生物系统公司（Applied Biosystems）工作，这是一家专门利用荧光技术进行桑格DNA自动测序的公司，其低通量技术是人类基因组项目的主力。索莱科萨董事会的一名成员联系了约翰·韦斯特，电话那头的人问他是否听说过一家名为索莱科萨的公司，是否有兴趣担任该公司的首席执行官。约翰听说过索莱科萨公司发明的荧光测序技术，但不清楚它如何从单个DNA分子中产生足够的荧光信号，所以他拒绝了这个提议。约翰认为，实现可靠成像并不需要大量增加荧光信号，也许只需要一到两个数量级就够了，但索莱科萨公司根本不具备这种能力。

然而几个月后，他了解到索莱科萨公司已经从曼泰亚（Manteia）公司获得了创造DNA“簇”的技术许可——DNA“小岛”上可以同时“生长”大约1000个相同的DNA分子。 这种技术引起了约翰的注意。与单个DNA分子相比，这种DNA簇技术可以将荧光信号提高三个级别。事实上，约翰之前曾建议应用生物系统公司购买同样的技术，希望能够借此改进测序技术，但领导层对此并不感兴趣。所以当他看到这个小型的英国生物技术公司获得这项技术时，他又给索莱科萨的董事长打电话问道：“你们还需要首席执行官吗？”

在接下来的几年里，随着约翰·韦斯特的加入，索莱科萨团队完成了一项具有里程碑意义的工作：他们对微生物体PhiX174的基因组——也就是弗雷德里克·桑格于1977年测序的含有5386个碱基的基因组——进行了测序。克莱夫并没有就此公开发表论文，而是在2005年2月的一封公司内部邮件中宣布索莱科萨成功地完成了PhiX174测序，展现了该公司真正的雄心：推出一款有竞争力的产品，对整个人类基因组进行测序。

从含有5386个碱基的单链DNA病毒到含有60亿个碱基的人类基因组，这条道路很漫长，但这家公司在不断壮大。2005年，约翰和索莱科萨公司的管理团队，包括公司前首席执行官尼克·麦库克，完成了与另外一家公司的“反向合并”。这是一家深陷困境的RNA测序公司，名为林克斯治疗公司，位于加州的海沃德市。索莱科萨这家私营公司收购了上市公司林克斯，并借其在纳斯达克上市，获取其客户基础和商用测序仪的分销系统。合并后的公司现在有两种不同的测序技术，因此必须做出重大战略决策，新公司应该采用哪种技术呢？加州人自然更青睐自己的技术，有些人甚至预测英国分部的业务会逐渐减少。但是约翰、克莱夫等人觉得，相比林克斯的技术，DNA簇测序的潜力更大，所以最终决定采用索莱科萨公司的技术。该团队迅速推出了第一个商业测序系统和基因组分析系统，并于2006年6月发售了首台以DNA簇“合成测序”为特征的测序仪。

人们对这款产品很感兴趣。虽然这些早期顾客知道“下一代”测序仪只不过是一个原型机，而且据反馈经常出故障，但订单还是源源不断，因为科学家认为该技术可能会大规模提升测序能力。这台测序仪不是对数百个DNA分子进行测序，而是可以同时读取包含数百万个不同分子的序列。围绕这台测序仪的讨论很快引起了基因组学领域的领跑者因美纳公司及其首席执行官杰伊·弗拉特利的注意。 总部位于加州圣迭戈市的因美纳公司当时是“寡核苷酸”制造商中的领头羊。寡核苷酸就是DNA的短片段，是构成微阵列技术的基础，这种技术可以在一个玻片上测量大量基因的表达水平。然而，因美纳公司还想扩大这项优势，也看到了测序领域的未来，并且正在寻求相应技术。不过，弗拉特利还没拿起电话，约翰·韦斯特就先联系了他。

索莱科萨团队注意到，即使他们有了高效的新测序仪，人类基因组测序的成本还是很高。第一台测序仪可以对10亿个碱基进行测序，这在当时看来似乎很了不起，但要用这项技术准确测定人类DNA序列，仅仅对基因组中的一个特定区域进行一次测序远远不够，我们需要对同一区域进行20多次测序，也就是说，如果想要深入研究人类基因组并获得可靠信息，需要对近1000亿个碱基进行测序。而且由于测序仪每次对一个区域测序需要三天，一台测序仪在不间断运行的情况下，对整个基因组进行测序需要的时间将长达一年，这实施起来似乎并不现实。因此，约翰及其团队开始把注意力集中于基因组中他们最感兴趣的部分。如果只对基因序列进行测序，忽略其他98%的基因组会怎么样呢？尽管当时已经很清楚，基因组的非基因部分绝对不是“垃圾”，但其功能，特别是与疾病之间的关联却不那么清楚。也许他们可以只对由基因构成的2%的基因组进行测序？他们的计划是合成数十万个寡核苷酸，将其作为“诱饵”，从任何给定的DNA样本中只找出感兴趣的区域。这将减少测序的工作量和成本，有些工作可能只需要一次测序就能完成。他们需要一个寡核苷酸供应商，所以约翰联系了因美纳公司。

约翰在圣迭戈的办公室里与因美纳公司首席执行官进行了一次成功的会面，敲定了一大笔寡核苷酸订单。当约翰起身准备离开时，弗拉特利拦住了他并问道：“就这些吗？没有别的要谈了吗？”2006年，索莱科萨被因美纳收购，股票交易值为6.5亿美元。如今，因美纳仅股票市值就接近90亿美元，许多人认为因美纳400亿美元的总估值主要来自在测序业务上的表现和潜力，而到目前为止，其测序业务完全建立在索莱科萨技术的基础上。

虽然弗拉特利和因美纳最初收购索莱科萨是想促进其基因芯片业务，但他们很快就认识到索莱科萨公司的技术可能会带来新的商机。收购后不久，随着研发加速，第二代基因组测序仪问世，测序片段长达75个碱基对，每天数据吞吐量达25亿个碱基。 ^[2] 这使因美纳一跃成为全球测序市场的前沿和中心。2010年，一项工程进展使得DNA簇可以在流通池的两个表面聚集，极大提高了测序输出。事实上，这种被称为“HiSeq”（高通量测序）的方法使同时对5个人的基因组进行测序成为可能（如果只对某些基因进行测序，则可以对100个人进行测序）。这种能力的大幅提升使因美纳测序仪在美国、中国和其他国家被大量使用。整个世界都意识到测序技术对科学和医学产生了革命性影响，测序单个外显子组和基因组的成本也在下降（大约相当于几美元就能买到那辆法拉利）。为庆祝新测序仪的推出，因美纳决定为10个人提供“个人”基因组测序。 因美纳首席执行官杰伊·弗拉特利排在测序名单的第一位。女演员格伦·克洛斯紧随其后。在由10个人组成的最初测序小组中，有4个人姓韦斯特。

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[1] 索莱科萨早期起源的故事来自克莱夫·布朗、约翰·韦斯特和凯文·戴维斯的面对面交谈。一些细节来自凯文·戴维斯的文章：Davies K. 13 Years Ago, a Beer Summit in an English Pub Led to the Birth of Solexa and-for Now at Least-the World's Most Popular Second-Generation Sequencing Technology. Bio-IT World. http://www.bio-itworld.com/2010/issues/sept-oct/solexa.html. Accessed January 11, 2019.

还有一些是来自他的著作《1000美元的基因组》：Davies K.The$1,000 Genome:The Scientif ic Breakthrough That Will Change Our Lives.New York:Free Press;2010.

[2] 第二代基因组测序仪输出统计数据：Genome Analyzer IIx System. Illumina. https://www.illumina.com/Documents/products/specifications/specification_genome_analyzer.pdf.

HiSeq（高通量测序）1000和2000输出统计：HiSeq Sequencing Systems. Illumina. https://www.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_hiseq_systems.pdf. ALDzXtnKwon0GHka6iGAPaO4ZCf2Ynxx8shhdmhsoiWjnHPxAinl0h4nKpFtSofs