第三节
临床表观遗传学检测和表观基因组学分析

一、DNA甲基化的临床分析

DNA甲基化检测非常适用于临床环境。目前，检测DNA甲基化的技术已广泛应用于临床研究。经过将近30年的发展，几乎所有技术都可以涵盖甲基化检测，如图3-3-1所示。甲基化检测技术可以归类为：①局部特定基因甲基化测定；②基于测序技术和微阵列的全基因组水平的基因组区域和全局测定；③全局DNA甲基化测定 。在临床应用中，任何表观遗传学测定方法都需要考虑以下三个方面：测定方法的可行性、已知基因表观遗传学的初始工作流程和未知基因表观基因组的初始工作流程，如下所示。

1．DNA甲基化检测的可行性

临床上，诊断方法的可行性取决于方法的选择，包括：①DNA样本的数量和质量，如福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本与液体活检样本之间的选择；②临床表观遗传学方法的敏感度和特异性；③测定方法的稳定性和简便性，以及专用设备、试剂和生物信息学软件的可用性。除了上述三个检测甲基化的要求之外，还应考虑临床工作流程，即发现患者发病的起始表观遗传变化的初始工作流程，或监测特定基因甲基化变化的初始工作流程。

2．已知基因表观遗传学的常规工作流程

对于已知基因，常规工作流程是一个非常实用的过程。目前，所有基于PCR的、焦磷酸测序的、限制性消化酶的测定都可用于检测已知的基因表观遗传学的改变 。我们已经报道了限制性消化酶测定方法 ，在这里我们将介绍另外两种技术。

（1）基于PCR的甲基化检测

目前，至少有四种基于PCR的甲基化检测方法：基于PCR的测序（PCR-based sequencing）、甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR）、高分辨率熔解PCR（PCR with high resolution melting）和用于未甲基化岛检测的低温变性共扩增PCR（COLD-PCR）。基于PCR的测序引物是根据CpG岛周围序列设计的（MethPrimer软件，http://www.urogene.org/methprimer），因此可用于亚硫酸氢盐转化的DNA的PCR扩增，所得的PCR产物可以被测序。直到最近，这还是证明感兴趣的CpG岛内单个CpG位点甲基化状态的唯一方法 。可用于亚硫酸氢盐转化的DNA的另一种方法是甲基化特异性PCR。这种方法检测甲基化需要设计两对引物：一对引物用于扩增甲基化的DNA，另一对引物用于扩增未甲基化的DNA。每个样本进行两次qPCR反应，然后根据其CT值的差异计算相对甲基化 。这种方法的缺点是一次只能评估一个或两个CpG位点的甲基化状态。可以在http://www.urogene.org/methprimer上找到设计甲基化特异性引物的程序。高分辨率熔解PCR和COLD-PCR通常在实验研究中用以检测未甲基化的岛。

（2）基于焦磷酸测序的甲基化检测

焦磷酸测序是另一种已知基因检测技术。可以请Qiagen公司单独设计基因引物或购买其PyroMark CpG Assays试剂盒。获得PCR产物后，进行短读长（short-read）焦磷酸测序反应（～100bp）。根据甲基化CpG的dGTP和未甲基化DNA的dATP的混合信号强度，每个CpG位点的甲基化水平能在测序区域内进行定量。该技术能够测定非常小的甲基化异常（＜5%）。对于异质肿瘤样本而言，这是一种很好的技术，因为对异质肿瘤样本，混合细胞中只有一小部分细胞具有差异化的甲基化基因异常。焦磷酸测序需要一些专用的设备来检测，例如Bio Molecular Systems的Qseq仪或Qiagen公司的PyroMark仪 。

3．从未知基因开始发现表观基因组异常的常规工作流程

在早期，我们通常使用随机限制性酶切消化DNA，并通过指纹（fingerprint）来发现癌前组织中DNA基因组水平上的SNP和表观基因组水平上的甲基化异常 。在如今的组学时代，我们可以使用基因组技术来揭示新的肿瘤抑制基因中的过甲基化。当前鉴定差异和未知甲基化区域的方法包括NGS、微阵列技术和Pacbio的SMRT DNA测序技术，如下所述。

（1）基于NGS的检测

目前，亚硫酸氢盐测序被认为是检测临床DNA甲基化异常的较好方法。由于DNA的亚硫酸氢盐处理可以将胞嘧啶转变为尿嘧啶，然后转化为胸腺嘧啶，而5-甲基胞嘧啶（5mC）残基可抵抗这种转变过程，因此甲基化的DNA可保持为胞嘧啶，然后转化为鸟嘌呤。根据这一原理，可以用一对未处理的DNA样本和经过亚硫酸氢盐处理的同一样本进行测序读取，从而可以检测出甲基化的胞嘧啶。随着NGS技术的出现，该方法可以扩展到整个基因组的DNA甲基化分析（称为全基因组亚硫酸氢盐测序，WGBS）。为了增加发现差异甲基化区域的测序覆盖率，科学家们还开发了富集方法，例如用抗甲基胞嘧啶结合蛋白（MBD）或抗5mC的抗体（MeDIP）来富集甲基化DNA。经过这些开发后，另一种可以增加覆盖率（因为CpG位点只存在于基因组中的部分区域）的NGS方法（称为简化代表性亚硫酸氢盐测序技术，RRBS）被用于测序。这种方法就像WGBS一样，可以使用任何可用的NGS平台（例如Illumina和Life Technologies，也包括华大的平台）进行测序，可分离出人类基因组中约85%的CpG岛。成功地进行MspI消化后，RRBS程序通常需要0.1～1μg的DNA 。此外，DNA甲基化测序的方法还有重亚硫酸盐处理后接头标记技术（PBAT） 、氧化-重亚硫酸盐测序（oxBS-Seq） 、TET辅助的重亚硫酸盐测序（TAB-seq） 、甲基化敏感度的限制酶测序（MRE-Seq） 、HELP-Seq 、甲基化DNA免疫共沉淀测序（MeDIP） 、甲基化结合域捕获技术（MBD-CAP） 和基于探针的靶向富集技术。安捷伦就提供了这种对富含CpG的区域或其他特定区域进行富集的方法，可以使用诱饵序列杂交固定的寡核苷酸，然后进行亚硫酸氢盐转化，这种技术被称为靶向亚硫酸氢盐测序，此类产品已经被市场化（例如，安捷伦的SureSelectXT甲基化测序靶向序列捕获基因组合） 。

（2）基于阵列的检测

通过免疫沉淀法获得的基因组甲基化DNA可以用于微阵列杂交。目前，还有两家大公司支持微阵列芯片或微珠，例如Affymetrix的GencChip Human Promoter 1.0R阵列和GeneChip Human Tiling 2.0R阵列套件 。这些阵列可以使用经亚硫酸氢盐转变的DNA来检测基因启动子区域、增强子调控元件和31个非翻译区（31UTRs）内的DNA甲基化。Illumina公司的Infinium MethylationEPIC Kit，每个样品在单核苷酸分辨率超过85万个甲基化位点，且可以定量研究，微珠芯片覆盖99%的已知基因，包括miRNA启动子、51UTR、31UTR、编码区和岛岸，仅需250ng的DNA即可完成实验。从技术上讲，将经过亚硫酸氢盐处理过的基因组DNA与检测寡核苷酸混合，其中一条与由原始未甲基化胞嘧啶而来的尿嘧啶互补，另一条与甲基化位点的胞嘧啶互补。通过杂交，将带有标记的检测寡核苷酸固定在带有条形码的微珠上，然后测量代表甲基化水平的信号。

（3）三代测序的甲基化检测

Pacbio的SMRT DNA测序技术可以直接测到碱基被修饰的状态，即利用动力学原理，聚合酶遇到带有甲基化的碱基，合成速度会明显变慢，而且光谱也会发生改变，可实现甲基化检测 。

二、组蛋白修饰的临床分析

尽管组蛋白标志物仍在研究中，但组蛋白翻译后修饰（histone posttranslational modification，PTM）的缺陷与肿瘤的发生发展有关。组蛋白修饰的临床分析步骤包括细胞核提取、组蛋白纯化和组蛋白富集。位点特异性修饰组蛋白、表征PTM结合蛋白的基于肽的系统和针对组蛋白修饰的特异性PTM抗体，可用于在体组蛋白修饰成像和各种分析染色质免疫沉淀样本的方法中。例如，一方面如果我们从临床样本中研究组蛋白PTM，则首先需要进行全细胞裂解和细胞核抽提，然后富集组蛋白的组分并纯化组蛋白，最后通过抗体识别对肿瘤组织样本和正常对照进行组蛋白PTM检测。目前，针对57种不同的组蛋白PTM有200种抗体可供选用 。另一方面，染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）可以检测特异性PTM组蛋白在基因组中的位置。结合PCR、微阵列和NGS技术，确定特异性PTM组蛋白的基因组位点的方法分别被称为ChIP分析法（结合下游PCR）、ChIP芯片（结合下游微阵列）和Chip-seq（结合下游NGS） 。目前，用于检测PTM组蛋白的临床样本的开发并不像检测DNA甲基化那么容易。一个成功的例子是对FFPE组织样本进行ChIP-seq分析 。尽管组蛋白修饰测定法在临床分析和诊断方法上的发展缓慢，但通过质谱检测组蛋白PTM已在组蛋白PTM的鉴定和定量临床分析中显示出可行性。最近，MALDI成像质谱法已用于检测患者组织中的组蛋白PTM变异体，因此MALDI原位成像质谱法会在不久的将来被用于临床分析 。 0SlyGt1qZXK3bVPF8XCFdncdoye4gs1Cs/c3nIMLoGkDTSiZWYDz3DJCmmvIWq6a