第二节
用于表观遗传学分析的临床取样

肿瘤抑制基因和原癌基因中的表观遗传异常在肿瘤发展中起重要作用。肿瘤细胞特异性CpG岛（富含CpG二核苷酸的区域）的异常甲基化可以用作检测癌细胞的标记。特定基因或基因组的甲基化是表观遗传学疗法的指征。甲基化组还可以预测化学疗法的效果和预后。例如，DNA去甲基化药物已经显示出对多种肿瘤有效。近年来，越来越多的肿瘤组织取样被用于诊断和靶向治疗。由于不同临床样本DNA稳定性不一样，将来自肿瘤患者的非癌组织（例如血浆、血清、尿液和唾液）的甲基化DNA作为一种肿瘤生物标志物也受到关注 。随着超敏感技术在过去十年的发展，液体活检（LB）中可操作的基因改变（即突变）的识别已成为一种常规做法，以决定是否应该应用靶向治疗。同样，对整体或特定表观遗传学改变的分析也可能作为诊断、预后甚至癌症药物反应的生物标记物 。

为了获得用于表观遗传学分析的良好样本，在这里我们将讨论两种类型的临床样本（肿瘤组织样本和非肿瘤组织样本）的获取方法，包括它们的优缺点。

一、从肿瘤组织获取肿瘤细胞样本

用于表观遗传学分析的肿瘤组织取样包括体外临床取样、离体临床取样和组织水平取样，然后用计算机对样本进行下游的临床表观遗传学分析。

1．体外临床取样

用于肿瘤细胞分离的体外临床取样技术包括MACS、FACS和LCM 。体外临床取样的MACS技术通常通过细胞表面生物标志物（例如CSC的CD133/CD44和CTC的EpCAM）对CSC和CTC进行分类。目前，MACS可以进行多色标记，通过阴性和／或阳性选择来特异性地收集肿瘤细胞和CTC，从而提高特定肿瘤细胞和CTC的收集纯度。FACS既可以像MACS一样，通过肿瘤细胞表面的特异性生物标志物分离肿瘤细胞或CSC，也可以通过不同于MACS的细胞内生物标志物进行分离。目前，多色流式细胞仪可以通过组合生物标志物一步法收集肿瘤细胞和CTC，从而也可以提高用于表观遗传学研究的肿瘤细胞的纯度。LCM依靠肿瘤细胞的形态及其在载玻片上的排列变化而具有明显的优势。LCM技术还可以在体内环境中特异性选择肿瘤细胞。结合抗体的染色方法（IHC/ICC）和基于DNA/RNA的染色可进一步提高具有特异性生物标志物的细胞纯度。在过去的几年中，随着LCM技术的研发和生物标志物的鉴定，LCM越来越多地用于高通量生物标志物筛选中。

2．离体临床取样

用于表观遗传学分析的离体临床样本包括CSC和原代癌细胞的培养物。1994年，我们报告了50例用于药物敏感度测定的原代培养肿瘤细胞的方法 。我们常规地使用了一些增加原代细胞数量的技术，使其可用于下游临床基因组分析和药物筛选，这样使临床样本中的CSC和肿瘤细胞培养及其下游表观遗传学分析在治疗靶向和药物筛选中发挥重要作用。

3．用于下游计算机临床表观遗传学分析的组织水平取样

在临床上，大多数通过手术切除的临床样本被直接在肿瘤组织水平上用液氮冷冻。如果组织水平的样本要进行表观基因组学分析，由于肿瘤组织中存在着混合细胞，那么用于下游计算机临床表观遗传学分析的组织水平取样对临床表观遗传学分析而言是非常重要的 。

二、液体活检和体液取样

用于表观遗传学分析的非肿瘤组织取样包括体液取样、细胞游离DNA（cfDNA）、CTC和外泌体 。尽管外泌体包含RNA、DNA和蛋白质，但我们更关注于DNA取样和检测，因此此处将介绍体液DNA、cfDNA和CTC-DNA的取样。

1．体液取样

从1990年代末到2000年代初，临床实验室发现肿瘤细胞残留在体液中，例如在尿液、痰液、支气管肺泡灌洗液（BAL）、乳腺抽吸液、唾液和粪便中都发现了肿瘤细胞。从这些肿瘤的脱落细胞中可以检测出残留在体液中的DNA，因此体液样本被广泛应用于表观遗传学检测中 。例如，在痰液样本中分析p16的甲基化，在尿液样本中分析谷胱甘肽S-转移酶P1的甲基化，在乳腺抽吸物样本中分析细胞周期蛋白D2、RARb、Twist、GSTP1、p16、p14、RASSFIA和DAPK的甲基化，在唾液样本中分析p16、DAPK和MGMT的甲基化，在尿液样本中分析DAPK、RARb、E-cadherin、APC、RASSF1A和p14的甲基化可以检测膀胱癌 。根据临床数据，一些商业产品已越来越多地用患者体液样本分析DNA的改变 。

2．细胞游离DNA

血流中的cfDNA（cell free DNA）被认为起源于凋亡细胞。尽管大多数这种DNA来自非恶性细胞，但晚期癌症患者血浆中的肿瘤细胞cfDNA含量却有所增加。在对cfDNA突变体检测的结果进行了广泛研究之后，我们发现了越来越多的表观遗传学异常 。血浆中发现的cfDNA的大小与组蛋白DNA的长度大小一致，为50～180bp。cfDNA的优点是可以从冷冻和新鲜血浆中获取并被分析，缺点是同一患者的cfDNA的丰度比CTC低，并且血液循环中cfDNA的半衰期短且cfDNA浓度易变，因此cfDNA的得率对于患者应用来说仍是一大挑战。此外，受野生型DNA背景中的异常变体的影响也是cfDNA临床应用的一大挑战 。为了克服这些困难，现已有很多公司开发了不同的产品和方法来检测cfDNA中的异常基因 。另外，操作方式的改进也可以增加样品中cfDNA的量。因为样品的搅动和转移过程可能会使cfDNA从裂解的有核血细胞中释放出来，所以血液凝集过程中发生的细胞裂解可使血浆中的cfDNA量远远优于血清中的 。

3．循环肿瘤细胞

CTC是一种从原发肿瘤部位转移到远端器官的过程中进入血液循环的肿瘤细胞。越来越多的研究显示，乳腺癌、前列腺癌、肺癌和大肠癌患者的循环血液中存在着肿瘤细胞 。20多年来，我们一直致力于从肿瘤患者和遗传病患者中富集临床稀有细胞 。临床证据表明，具有转移性病变的患者每1毫升全血中的CTC的数量更可能高达1～10个。如上节所述，从大约10毫升的血液中分离CTC的基本步骤包括梯度离心和阴性选择（CD45）／阳性选择（CD326），该过程被称为CTC富集 。CTC很脆弱，当收集在标准的真空采血管中时，它们往往会降解。为了解决这一问题，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了一种实用的CTC管 Cellsave ，用于收集临床样本，样本抽入 Cellsave 储存管后可保存96小时 。

在了解了表观遗传学的临床取样过程之后，我们需要确定哪种患者样本最适合于下游实验的处理分析。由于肿瘤的高度异质性，一旦患者有肿瘤样本可采集，就首先需要对肿瘤组织进行取样以便进行个体化治疗。如果医师需要纵向监测分子变化或需要筛选表观遗传学改变以检测肿瘤生物标志物、预测肿瘤预后和监测患者对肿瘤治疗的应答，则首选液体活检，因为它易于多次获取且具有微创性的优点，表3-2-1总结了用于表观遗传学分析的临床取样方法的应用及优点 。