第三节
临床GWAS检测与分析

SNP是所有基因变异中最常见的变异类型。SNP是特定位点的单个碱基对突变，通常涉及两个等位基因（其中罕见等位基因发生率＞1%） 。国际人类基因组单体型图计划（简称HapMap计划）中的SNP将提供人类疾病基因型所需的最少SNP集。SNP与许多人类疾病的发展有关，可以为药物遗传学治疗提供相关依据。

为了清楚地解释个体化靶向治疗（personalized targeted therapy，PTT）的过程，在这里，我们总结了一些检测手段及分析方法，包括以下由系统方法（基因组水平的全部SNP检测）和局部方法（经设计的SNP基因检测）定义的SNP图谱。在系统SNP分析中，已将几种新技术用于全部SNP检测（或称为全局基因组水平测定），包括：将互补DNA探针与SNP位点杂交的SNP微阵列，通过对样本进行分组来读取整个基因组的NGS技术 ，以及更新发展的三代、四代测序技术 。

SNP微阵列是高密度寡核苷酸SNP阵列，有成千上万个探针排列在一个小芯片上，以检测一对临床DNA样本中全部的SNP。目前，Affymetrix和Illumina公司提供此类产品，例如Affymetrix的人类SNP 6.0基因芯片含有超过90万个SNP以及超过94万个用于检测拷贝数变异的探针；Illumina的Infinium ^TM CytoSNP-850K v1.2 BeadChip覆盖85万个15倍冗余的SNP位点。由于SNP等位基因仅在一个核苷酸上有差异，并且由于很难为阵列上的所有探针获得最佳的杂交条件，因此可能出现探针与目标DNA的错配，错配的探针对目标DNA的检测可能构成影响，这是SNP微阵列技术最大的难点。为了解决错配问题，商业公司在设计微阵列探针时，会在一个SNP位点上设计多个不同对照探针，其中包含SNP等位基因中的错配。通过比较目标DNA与这些多重对照探针各自杂交的差异量，可以帮助确定特定的纯合和杂合等位基因。

NGS系统是第二个可以进行全部SNP检测的系统，由于其通量比SNP微阵列更高，所以发展快速，它可以使用从NGS数据中获得的单核苷酸变体（single nucleotide variants，SNV）数据来识别配对样本中的所有SNV。如图2-1-1所示，我们已发表的论文和已出版的专著采用了三种NGS技术用于SNP的检测，包括全基因组DNA测序（whole genomic DNA-Seq，WGS）、全外显子组测序（whole exome-Seq，WES）和RNA测序（RNA-Seq） ， 。如图2-3-1所示，计算技术已经成功应用于从对比样本中识别出稀有SNP，以及从单个个体的多个组织样本中检测出SNV 。这三种检测SNV的NGS方法具有不同的优缺点。例如，RNA-Seq可以同时检测转录组和SNV（图2-1-1A），这可能有助于下游的系统模型发现SNP特征，但缺点是实验所用的初始样本是容易降解的RNA；而DNA-Seq（包括WGS和WES两种技术）的优点是初始样本是非常稳定且易于扩增的DNA；这三种方法中WGS的通量最高（图2-1-1B），可检测包括编码和非编码DNA在内的序列的所有SNV，而WES（图2-1-1C）比WGS的性价比要高一些，但获得的关键信息仅相当于WGS的2%左右，因此通量要低于WGS。

另一方面，经设计的SNP检测的技术也正在迅速发展。Preisler于2002年为用于诊断白血病的一组特定的SNP的检测方法申请了专利。在那之后的20年中，许多用于SNP基因分型组合的新技术得到了长足的发展。近年来，SNP可以在各种疾病病程中被很容易地检测到。经设计的SNP基因分型方案包括如图2-3-2 所示的三个步骤：目标片段扩增、等位基因识别和产物检测／鉴定。除了“入侵者”技术（invader technology）以外，几乎可以使用所有的PCR技术对目标DNA拷贝进行10 ⁹ 倍的扩增。等位基因识别是SNP基因分型的关键。由DNA聚合酶和DNA连接酶产生的识别力可以高特异性、高准确性地区分匹配和错配的DNA双链体。等位基因识别可以利用杂交、连接和DNA聚合酶的5′核酸酶活性结合其PCR来实现，从而创建了分子信标（molecular beacons）法、Taq-Man法和FRET-DOL法的PCR技术。这些单步操作的一孔／一管式分析步骤可以简化自动化的操作流程。这些方法的特异性和准确性主要取决于反应体系中使用的酶：最佳特异性排名依次为DNA连接酶、核酸内切酶和等位基因特异性杂交，但DNA聚合酶的特异性因不同酶的活性不同而有异。最后一步是检测和鉴定等位基因特异性产物。DNA扩增产物经过额外的纯化步骤后，可以通过质谱、荧光共振能量转移（FRET）、荧光偏振（FP）、发光、吸收度和解链温度进行产物检测和鉴定。大多数检测系统具有内置设置，可以对大量样本进行重复性检测，例如在96和384孔板上检测大量样本或在固体膜上同时进行大量杂交反应 ， 。

由于市场上可供使用的产品较多，临床科学家和医师在选择合适产品时可能会面临困惑。本章表2-3-1总结了一些SNP技术和试剂盒，归纳其优／缺点、等级／通量以及这些技术的临床应用成本。当然，我们的重点是放在SNP检测的治疗应用中，这将在下一部分进行介绍。