实验3
玉米中天然色素
——玉米黄质的提取、分离和分析

一、实验目的

1.学习并掌握超声提取法提取玉米中玉米黄质的操作方法。

2.学习并掌握薄层色谱法分离玉米中玉米黄质的原理和方法。

3.掌握高效液相色谱法测定玉米黄质的技术。

二、实验原理

玉米黄质（zeaxanthin）又称玉米黄素，因最先在玉米中被发现而得名，是黄玉米的主要呈色色素，属于含氧类胡萝卜素中的二羟基类胡萝卜素，与叶黄素互为同分异构体，是一种橘红色的结晶粉末，易溶于乙醇、丙酮和脂类等有机溶剂，属于脂溶性化合物，不易溶于水，对光和热极敏感，且对铁离子和铝离子的稳定性差。图1-4为玉米黄质的结构式，共有11个共轭双键，两端各连接一个带羟基的紫罗酮环，化学式为C ₄₀ H ₅₆ O ₂ ，分子量为568.88。玉米黄质作为一种天然、绿色的色素，常被应用于各种食物，其含有的多个共轭双键使其具有较强的抗氧化特性，可以用来预防或治疗因氧化应激或氧化损伤而诱导的眼部及其他疾病。此外，玉米黄质在预防膀胱癌、食道癌、前列腺癌以及治疗乳腺癌、结肠癌等癌症中具有良好的效果。

由于玉米黄质不可由人体自身合成，故只能通过饮食摄入，而在日常饮食中玉米、蛋黄和胡椒是玉米黄质最主要的来源。此外，玉米黄质也可以通过菌体合成。目前，玉米黄质的商业化生产主要是化学合成或从玉米、万寿菊、紫花苜蓿等中药植物组织中提取。

1.天然色素的提取方法

玉米中天然色素的提取方法主要有有机溶剂提取法、超临界CO ₂ 萃取法、酶解法和超声提取法。

（1）溶剂提取法

玉米黄质作为脂溶性色素，易溶于乙醇和石油醚等有机溶剂。采用单一的有机溶剂对万寿菊等植物内的玉米黄质进行提取是传统方法，也是工业中最常用的方法。其中，乙醇因价格低廉且无毒害作用成为最广泛应用的提取剂，但使用乙醇提取时蛋白质会溶于其中，故提取前应先将原料中的蛋白质除去。研究发现，选择两种或多种溶剂进行混合提取，可以有效提高玉米黄质的提取效率，如将提取溶剂丙酮和石油醚以1∶1（体积比）进行混合作为提取溶剂可使其得率有所提高。虽然溶剂提取法较为方便，并且操作简单，但其提取效率较低，还可能出现溶剂残留等问题。

（2）超临界CO ₂ 流体萃取法

超临界CO ₂ 流体萃取法具有高效、环保、节能、易控等特点，是一项高效且成熟的技术，可保护热敏物质和活性物质不受损害。采用超临界CO ₂ 流体萃取法对同为色素的辣椒红色素进行提取，可以提高提取率，并且得到的产品色价也较高。超临界CO ₂ 流体萃取法操作温度低，无溶剂残留，提取率高。该技术受到广泛关注，但产品的生产成本由于设备投资和维护成本高昂也随之增加，因此其普及性受到限制。

（3）酶解法

酶解法具有微量、高效的特点，可增加活性物质的提取率。利用酶解法进行玉米黄质提取时，因其对温度较为敏感且不耐酸碱，故酶解通常于室温且中性的条件下进行。通常玉米黄质会以与蛋白质类物质聚合或被纤维素等物质包裹的形式存在于植物体中，并非以单体形式存在，因此适当地将提取原料中的蛋白质或纤维素等物质水解可有效提高玉米黄质的提取率。因酶解法效率高且无残留，故可单独作为一种提取方法，也可作为一种辅助方法与其他提取方式结合，进一步提高活性物质的提取率。

（4）超声提取法

超声提取法在低温条件下仍具有较高萃取率，原因在于超声波的频率较高，可以将原料的细胞壁破坏，使活性物质更好地从原料中析出并溶解于提取液中；在提取过程中会产生一种“空化泡”，其压力可达到1MPa以上，在炸裂瞬间产生的能量可以使提取物质有效析出，从而加速活性物质的提取；原料在超声波的作用下还可受到来自提取液各方向的作用力，使其触碰率有所提高。

2.玉米黄质的分离及分析

薄层层析，又称薄层色谱，是平面色谱的一种，其原理是试样中的各组分在固定相与流动相之间借助毛细作用发生多次吸附-溶解作用，从而使不同物质上升距离不同而分离开来。该法简单、快速、操作方便，是快速分离和定性分析少量物质的一种重要实验技术，属固-液吸附色谱，兼备了柱色谱和纸色谱的优点，可用于少量样品的分离及精制，适用于挥发性较小或较高温度易发生变化的物质。玉米粉中天然色素薄层层析分离可以根据不同的组分选择合适的吸附剂来进行，通过毛细管点样玉米黄质提取液操作进行分离，选择合适展开剂放入层析缸中，展开完得到纯组分，然后利用高效液相色谱对纯组分进行分析。

三、实验仪器与试剂

1.仪器

电子分析天平，数控超声波清洗器，数显恒温水浴锅，圆盖高型染色缸，硅胶板GF254（25mm×75mm），容量瓶（50mL），高速离心机，玻璃点样毛细管，有机系滤膜，紫外分光光度计，高效液相色谱仪。

2.试剂

玉米黄质（HPLC≥85%），甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），石油醚，乙酸乙酯，三乙胺，玉米粉（市售）。

四、实验步骤

1.玉米黄质储备液的配制

准确称取标准品玉米黄质0.0050 g（精确到0.0001 g），加入甲醇溶液，超声溶解后，转移至50mL容量瓶用甲醇定容，玉米黄质标准储备溶液的浓度为100μg/mL。

2.玉米黄质的超声波法提取

准确称取玉米粉4.0 g放入离心管中，加入8.00mL甲醇，放入超声波清洗器中超声30min，设置超声功率为150 W，工作频率为40 kHz。超声完成后，置于高速离心机中离心5min，转速为10000 r/min，取上清液，备用。

3.薄层层析分离

移取上述提取的上清液200μL，用甲醇定容到2mL；另取标准储备溶液（100μg/mL, c _标 ）和3块硅胶板。展开剂选择石油醚/乙酸乙酯/三乙胺（体积比为6∶3∶1），加入展开剂的高度为0.5 cm。分别用毛细管在硅胶板上进行点样，点样距离为距硅胶板一端1 cm处；每张硅胶板点2个点，分别为1个标样点和1个样品点。待展开剂上升至距离顶端0.5 cm时，取出点样板。分别将标样斑点、样品上和标样相同高度的斑点用小刀刮入离心管中，分别向装入斑点的离心管中加入1.5mL甲醇，超声溶解5min，转速为10000 r/min离心5min，取上清液。上清液用0.45μm有机系滤膜过滤装入液相样品瓶中，分别为标样1、标样2、标样3、样品1、样品2、样品3，待测试。

4.高效液相色谱（HPLC）检测

（1）玉米黄质保留时间的确定

使用浓度为10.0μg/mL的玉米黄质标准溶液，按照表1-11中液相色谱条件，测定其保留时间。

（2）空白实验

在上述色谱条件下，用溶解玉米黄质的溶剂甲醇作为空白试验。

（3）样品的测定

利用HPLC测出薄层分离后的6个样品的峰面积和保留时间。

五、数据记录与处理

1.玉米黄质标样的保留时间为___min。

2.根据测定样品的色谱图，填写表1-12。

3.玉米粉中玉米黄质含量的计算：

式中： m _玉米黄质 为玉米黄质的质量，单位为μg/g; c _样 的单位为μg/mL; V 为固体样品中加入甲醇的体积，单位为mL; m _s 为玉米粉的质量，单位为g; n 为稀释倍数。

六、思考与讨论

1.根据玉米黄质的性质，除了甲醇还可以用什么溶剂提取？

2.薄层层析法如何进行定性与定量分析？

3.为使玉米黄质的保留时间变短，应如何调整色谱条件？

参考文献

[1] 李晓玲,孙永华,王文亮,等.玉米黄色素提取纯化及分析检测研究进展[J].中国食物与营养,2013,19（3）:59-62.

[2] 孙丽丽,张智杰,郑永杰.玉米黄色素的提取和分析[J].齐齐哈尔大学学报,2009,25（1）:74-78.

[3] 冯继华.玉米黄色素粗品分析及其精制方法[J].西南民族大学学报（自然科学版）,1991（4）:55-59. Giy3n8uH18n7/09EGy6MSaZNAiDu7yIfd7uixD3PBDYvCw+6NcX339K/7MA+OBc/