实验1
含乳饮料中食品添加剂的样品前处理及测定

食品添加剂是指为了改善食品品质、色香味以及满足防腐和加工工艺的需要而加入食品的天然或化学合成物质。食品添加剂种类很多，包括着色剂、酶制剂、香料、膨松剂、甜味剂、抗氧化剂、防腐剂、增稠剂、漂白剂、抗结剂、营养增强剂等。为了保证食品安全，食品添加剂的使用量应该符合食品安全国家标准，食品添加剂的含量一般较低，需采用仪器分析方法进行测定。测定金属元素一般采用原子光谱法，如原子吸收光谱、原子反射光谱等。测定沸点较低、热稳定性好的有机物一般采用气相色谱方法，而对于沸点较高的有机物则可以采用液相色谱法进行测定。

娃哈哈AD钙奶是一款受儿童欢迎的饮品，其配料表如图1-1所示：

从配料表中可以看出，该产品中含有防腐剂——山梨酸钾，甜味剂——阿斯巴甜和安赛蜜，营养增强剂——碳酸钙、维生素A和维生素D等。其中山梨酸钾、阿斯巴甜和安赛蜜含量未给出，而这些物质的含量应该符合国家食品安全标准，同时，碳酸钙含量应该与产品标签上的标示量一致。

（一）分散液-液微萃取气相色谱法测定食品中的防腐剂

一、实验目的

1.理解气相色谱分析中对测试溶液的要求。

2.掌握分散液-液微萃取的原理和基本操作。

3.掌握实际样品加标回收率实验方法。

二、实验原理

山梨酸和苯甲酸是两种常见的防腐剂，广泛用于食品中。但是根据食品安全国家标准的规定，食品防腐剂的含量不能超过一定的限量，如含乳饮料中的山梨酸和苯甲酸的限量均为1mg/kg。根据食品安全国家标准，食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量采用传统的液-液萃取方法测定。本实验利用分散液-液微萃取法提取液体食品中的山梨酸和苯甲酸，以弱极性毛细管柱分离山梨酸和苯甲酸，以FID（氢火焰离子化检测器）为检测器，利用保留时间定性确定样品中的防腐剂种类，并采用直接比较法确定防腐剂含量。

三、实验仪器与试剂

1.仪器

毛细管气相色谱仪（配FID检测器），超声波清洗仪，电子天平，高速离心机，小型离心机，涡旋振荡仪，容量瓶（5mL、25mL、100mL），塑料离心管（1mL、10mL），多功能离心管架，移液枪（100μL），气相色谱进样针（5μL）。

2.毛细管气相色谱仪各参数

色谱条件：Rtx-5柱，30m×ø0.3mm，膜厚0.25μm。

载气：N ₂ ,99.995%；进样口温度（injection temperature, T _i ）=250℃。

进样方式（injection mode）：分流（split）；分流比（split ratio）=20∶1。

流量控制（flow control）：线速度；线速（linear velocity）=40 cm/s。

柱温（ T _c ）=145℃；检测器温度（ T _D ）=250℃。

H ₂ ∶40mL/min。尾吹气（N ₂ ）:40mL/min。空气：400mL/min。氢气：40mL/min。进样量：1μL（液）。H ₂ ∶0.4MPa。空气：0.5MPa。

3.试剂

浓盐酸，氯化钠，山梨酸，苯甲酸，乙酸锌，亚铁氰化钾，乙酸乙酯，二氯甲烷，乙醇，市售AD钙奶。

四、实验步骤

（一）溶液配制

1.10.0mg/mL苯甲酸乙醇溶液和10.0mg/mL山梨酸乙醇溶液的配制

分别准确称取0.0500 g山梨酸和苯甲酸于两个5mL容量瓶中，分别加入乙醇，超声溶解，用乙醇定容，即得。

2.0.10mg/mL苯甲酸乙醇标准溶液和0.10mg/mL山梨酸乙醇标准溶液的配制

分别用移液枪准确移取10mg/mL的苯甲酸和山梨酸乙醇溶液各0.050mL于两个5mL容量瓶，并用乙醇定容，即得。

3.1mg/mL苯甲酸水溶液和1mg/mL山梨酸水溶液的配制

分别准确称取0.1000 g山梨酸和苯甲酸于两个100mL容量瓶中，分别加入5mL乙醇，超声溶解，用水定容至100mL，即得。

4.50μg/mL苯甲酸和山梨酸混合标准溶液的配制

分别准确移取1mg/mL的苯甲酸和山梨酸水溶液5.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，即得。

5.1mol/L盐酸溶液的配制

移取42mL浓盐酸，加入500mL水，摇匀即得。

6.12%乙酸锌溶液的配制

称取60 g乙酸锌，加水500mL溶解，即得。

7.12%亚铁氰化钾溶液的配制

称取60 g亚铁氰化钾，加水500mL溶解，即得。

8.DEA萃取剂的配制

准确移取9.00mL二氯甲烷和1.00mL乙酸乙酯，混合均匀，即得。

（二）样品制备

1.准确称取2.5 g的AD钙奶于25mL容量瓶中，用水定容，即得样品试液。

2.样品试液除蛋白：取样品试液8.0mL于塑料带盖离心管中，加入1.0mL 12%的乙酸锌溶液和1.0mL 12%的亚铁氰化钾溶液沉淀剂，涡旋振荡2min后，离心分离，转速为12000 r/min，时间5min，移取上层清液备用。

（三）超声分散液-液微萃取提取样品溶液中的山梨酸和苯甲酸

分别移取1.00mL已除蛋白的样品试液和1.00mL 50μg/mL苯甲酸和山梨酸混合标准溶液于两个1mL带盖尖头离心管中，分别加入少量（2滴）1mol/L盐酸溶液，调至溶液pH为3.0左右，再分次加入适量氯化钠（0.3 g左右），振摇（涡旋）至完全溶解，继续加入25μL DEA萃取剂，超声3min，涡旋3min，室温下4000 r/min离心2min。将气相色谱进样针插入底层，移取下层溶液1μL进样分析。

（四）加标回收率实验

准确称取2.5 g的AD钙奶于25mL容量瓶，加入0.20mL 1mg/mL的山梨酸和苯甲酸水溶液，用水定容至25mL。利用步骤（二）除蛋白后，按步骤（三）进行分散液-液微萃取，移取下层溶液进行气相色谱分析。

（五）气相色谱分析

1.分别移取1μL 0.10mg/mL苯甲酸乙醇标准溶液和山梨酸乙醇标准溶液进样，得到苯甲酸和山梨酸的色谱图，记录苯甲酸和山梨酸的保留时间，用于定性分析。

2.分别移取1μL苯甲酸和山梨酸混合标准溶液经分散液-液萃取后的萃取液、去蛋白后样品溶液经分散液-液微萃取后的萃取液、加标样品溶液经分散液-液微萃取后的萃取液进样分析，分别记录相应色谱，根据保留时间定性后，记录苯甲酸和山梨酸的峰面积。

五、数据记录与处理

1.根据山梨酸标准溶液、苯甲酸标准溶液、混合标准溶液、样品溶液、加标样品溶液的色谱图，完成表1-1。

2.根据表1-1判断样品中含有的防腐剂种类，列出样品中所含山梨酸和苯甲酸含量的计算公式，计算相应防腐剂的含量（g/kg），并判断样品中防腐剂是否超标。

3.加标回收率实验数据。

4.根据加标回收率结果评价该样品处理方法是否合适，并判断该饮料中防腐剂是否超标。

六、注意事项

1.加入NaCl时，一定要分次加入，在加入萃取剂DEA之前一定要确保加入待萃取溶液中的NaCl全部溶解。

2.萃取离心后一定要注意观察底部的萃取液里是否有固体，当没有固体时才可将微量进样器的底部插入尖头离心管的最下端移取样品，进行气相色谱分析。

3.每次进样结束后，进样针都要用DEA溶液洗20次以上，方可再次使用。

七、思考与讨论

1.食品安全国家标准中气相色谱法测定食品中山梨酸和苯甲酸的样品处理方法是怎样的？

2.本实验采用的样品前处理方法与国标法相比有何优点和缺点？

参考文献

[1] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准:GB 2760—2014[S].北京:中国标准出版社,2014.

[2] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定:GB 5009.28—2016[S].北京:中国标准出版社,2016.

[3] 杨金玲,江阳,薛勇,等.超声分散液相微萃取-气相色谱法同时测定食品中11种防腐剂[J].济宁医学院学报,2015,38（1）:47-50,56.

（二）液相色谱法测定AD钙奶中的甜味剂

一、实验目的

1.学习并掌握测定乳制品中痕量物质的常见样品前处理方法。

2.理解液相色谱分析中对测试溶液的要求。

3.掌握加标回收率实验的方法及计算方法。

二、实验原理

甜味剂是一种人工合成或半合成的赋予食品甜味的食品添加剂，是可替代蔗糖的有机化合物。由于其在人体内几乎不被代谢，热量小，具有高强度甜度（甜度是蔗糖的几十倍甚至上百倍），因而被广泛应用在食品中。目前应用比较广泛的甜味剂有糖精钠、阿斯巴甜、安赛蜜等。虽然甜味剂为合法添加剂，但随着使用量逐渐增多，其对生态环境和人类健康存在潜在风险，因此，在国家卫生标准中是有限量要求的。

本实验利用高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography,HPLC）对AD钙奶中的甜味剂安赛蜜和阿斯巴甜进行测定。AD钙奶作为一种乳饮料，含有牛乳、增稠剂以及蛋白等，而这些对整个色谱系统，尤其是对液相色谱柱会产生不良影响，因此进行测定前，必须除去蛋白质的干扰。本实验选择乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液作为蛋白沉淀剂，因为安赛蜜和阿斯巴甜的水溶性较好，可以用水作为提取溶剂，经离心后沉淀蛋白，并将上清液过滤后直接进样，利用反相色谱柱、紫外检测器对两种甜味剂进行同时检测。

三、实验仪器与试剂

1.仪器

HP1100高效液相色谱仪（配G1315B二极管阵列检测器和Rev.A.08.03色谱工作站），超声振荡器，高速离心机，pH计，电子天平，冰箱，微孔滤膜（水系），移液枪，容量瓶（100mL、50mL、25mL、10mL）。

2.HP1100高效液相色谱仪各参数

色谱条件：Symmetry C 18色谱柱4.6mm× 250mm。检测波长：205 nm。柱温：25℃。进样体积：10μL。

流动相由乙腈和磷酸盐缓冲液（pH=5.0）组成，流速1.0mL/min。

梯度洗脱程序：0~4min，乙腈的体积分数为5%;4~10min，乙腈的体积分数由5%增至40%;10~11min，乙腈的体积分数由40%减至5%。

3.试剂

乙腈（色谱纯），氢氧化钠、磷酸二氢钠、乙酸锌、亚铁氰化钾均为分析纯，安赛蜜（乙酰磺胺酸钾）标准品、阿斯巴甜标准品，实验用水均为电导率为18.2MΩ的去离子水。

四、实验步骤

（一）溶液配制

1.10mmol/L磷酸盐缓冲液（pH=5.0）的配制

称取1.200 g磷酸二氢钠，加水至1000mL溶解，用0.1mol/L NaOH溶液调至pH=5.0，经0.45μm滤膜过滤，超声脱气15min备用。

2.12%的乙酸锌溶液的配制

称取60 g乙酸锌，加水500mL溶解，即得。

3.12%的亚铁氰化钾溶液的配制

称取60 g亚铁氰化钾，加水500mL溶解，即得。

4.安赛蜜、阿斯巴甜储备液的配制

准确称取各标准品50.0mg，加水溶解，转移至50mL容量瓶中，用水定容，此溶液含各标准品浓度均为1.00mg/mL。

5.安赛蜜、阿斯巴甜定性溶液的配制

分别准确吸取安赛蜜、阿斯巴甜标准储备液各0.50mL于两个25mL容量瓶中，得到20.0μg/mL的安赛蜜溶液和阿斯巴甜溶液。

6.混合标准使用溶液的配制

准确吸取安赛蜜、阿斯巴甜标准储备液各5.00mL于100mL容量瓶中，加水至刻度，得到各甜味剂浓度均为0.05mg/mL的混合标准使用溶液。

7.系列混合标准液的配制

分别吸取上述混合标准使用溶液1.00mL、2.00mL、4.00mL、8.00mL、10.00mL于10mL容量瓶，各加水定容至刻度，即得含安赛蜜、阿斯巴甜标准品浓度为5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL的系列混合标准液。

（二）样品前处理

称取约3 g匀质的乳饮料样品（精确到0.001 g）于10mL比色管（或10mL带塞塑料离心管）中，加入12%的乙酸锌溶液2.0mL和12%的亚铁氰化钾溶液2.0mL，加水至刻度，摇匀（或超声振荡30min），放入冰箱的冷冻格静置30min，使蛋白沉淀。将样液以12000 r/min离心5min，取上清液过0.45μm滤膜，待液相色谱上机测定。

（三）加标回收率实验

准确称取约3 g匀质的乳饮料样品（精确到0.001 g）于10mL比色管（或10mL带塞塑料离心管）中，依次加入0.10mL的1.00mg/mL的阿斯巴甜和安赛蜜标准储备液，摇匀，按照样品同样的处理方法处理，得到加标以后的样品溶液。

（四）高效液相色谱测定

1.定性分析

分别移取浓度为20.00μg/mL的安赛蜜和阿斯巴甜标准溶液各10μL，分别进样，进行HPLC分析，得到安赛蜜和阿巴斯甜的色谱图。

2.标准曲线的绘制

分别移取浓度为5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL的安赛蜜和阿斯巴甜的混合标准溶液各10μL，分别进样，进行HPLC分析，得到不同浓度的色谱图。以安赛蜜和阿斯巴甜的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，线性拟合，绘制标准曲线，得到线性回归方程。

3.样品测定

分别取样品处理液和加标后的样品溶液，自动进样1μL（10μL），以保留时间定性，根据外标法（或直接比较法）以峰面积定量。

五、数据记录与处理

1.称取AD钙奶的质量： m _s =___。

2.阿巴斯甜的保留时间：___。

安赛蜜的保留时间：___。

3.标准溶液及样品溶液中阿斯巴甜和安赛蜜的峰面积数据。

根据阿斯巴甜和安赛蜜的峰面积与浓度进行线性拟合，得到的线性回归方程分别为：________、________。

4.根据线性回归方程计算测试液中阿斯巴甜与安赛蜜的浓度，并计算样品中所含阿斯巴甜与安赛蜜的含量（以mg/kg表示）。

5.加标回收率实验数据。

6.根据加标回收率结果评价该样品处理方法是否合适，并判断该饮料中甜味剂是否合格。

六、注意事项

1.离心后，上清液移取过程中一定要注意不要碰到下层沉淀，上清液要用水性滤膜过滤，将过滤液承接到1mL离心管中，贴好标签备用。

2.原则上，加标回收率实验中加标后的样品溶液的浓度要在线性范围之内，可根据测定值适当增减。

七、思考与讨论

1.AD钙奶的样品前处理过程中加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液的作用是什么？

2.查阅健怡可口可乐饮料的配料表，如果要测定健怡可口可乐饮料中的甜味剂，请你设计合适的样品前处理过程。

参考文献

[1] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准:GB 2760—2014[S].北京:中国标准出版社,2014.

[2] 鲁琳,杭义萍,高燕红.高效液相色谱法快速检测乳饮料中常用甜味剂[J].食品科学,2009,30（10）:166-168.

[3] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中阿斯巴甜和阿力甜的测定:GB 5009.263—2016[S].北京:中国标准出版社,2016.

（三）干灰化法-原子吸收光谱法测定AD钙奶中的钙含量

一、实验目的

1.了解测定金属元素常用的样品前处理方法及各种方法的优缺点。

2.掌握干灰化法的原理及方法。

3.掌握原子吸收分光光度计的原理、使用方法。

二、实验原理

欲测定试样中的无机元素，需首先将样品消解，去除试样中的有机物。分解试样的方法可分为湿法和干法两种。干灰化法是指将样品置于敞口皿或坩埚内，在空气中一定温度范围（500℃~550℃）内，加热分解，灰化，所得残渣用适当溶剂溶解后进行测定。此法常用于测定有机物或生物试样中的无机元素。

原子吸收光谱法也称原子吸收分光光度法，简称原子吸收法。原子吸收法根据原子化器不同可分为火焰原子吸收光谱法和石墨炉原子吸收光谱法。火焰原子吸收光谱法是将含待测元素的样品溶液通过原子化系统喷成细雾，随载气进入火焰，并在火焰中解离成基态原子。当空心阴极灯辐射出待测元素的特征光通过火焰时，因被火焰中待测元素的基态原子吸收而减弱。在一定实验条件下，特征光强的变化与火焰中待测元素基态原子的浓度有定量关系，故只需测得吸光度，就可以求出样品溶液中待测元素的浓度。

本实验利用干灰化法将AD钙奶试样消解处理后，经原子吸收火焰原子化，在422.7 nm波长处测定吸光度值，测得的吸光度值在一定浓度范围内与试样中钙含量成正比，与标准系列比较可定量。

三、实验仪器与试剂

1.仪器

原子吸收光谱仪（配火焰原子化器、钙空心阴极灯），分析天平（感量为0.1mg和1mg），马弗炉，恒温干燥箱，移液枪（1mL），容量瓶（10mL、25mL、50mL、1000mL），离心管（10mL），瓷坩埚，电热套。

注：所有玻璃器皿及聚四氟乙烯消解内罐均需硝酸溶液（1+5）浸泡过夜，用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水冲洗干净。

2.试剂

碳酸钙，纯度>99.99%，或经国家认证并授予标准物质证书的一定浓度的钙标准溶液；硝酸、浓盐酸均为分析纯。

四、实验步骤

（一）溶液配制

1.硝酸溶液（5+95）：量取50mL浓硝酸，加入950mL水，混匀即得。

2.标准品溶液的配制：

（1）钙标准储备液（1000mg/L）：准确称取2.4963 g（精确至0.0001 g）碳酸钙，加盐酸溶液（1+1）溶解，移入1000mL容量瓶中，加水定容。

（2）钙标准中间液（10mg/L）：准确吸取钙标准储备液（1000mg/L）0.50mL于50mL容量瓶中，加水至刻度定容。

（3）钙标准系列溶液：分别吸取钙标准中间液（10mg/L）0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL于5个10mL容量瓶（或10mL离心管）中，加水定容至刻度。此钙标准系列溶液中钙的质量浓度分别为0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、4.00mg/L和6.00mg/L。以蒸馏水为空白对照，记录其他标准溶液的吸光度值。

注：可根据仪器的灵敏度及样品中钙的实际含量确定标准溶液系列中元素的具体浓度。

（二）样品前处理

准确移取液体试样0.50mL于瓷坩埚中，小火加热，炭化至无烟，转移至马弗炉中，于550℃灰化1.5~2 h，待冷却后取出，试样应呈白灰状。对于灰化不彻底的试样，加数滴硝酸，小火加热并蒸干，再转入550℃马弗炉中，继续灰化1~2 h，至试样呈白灰状，冷却后取出，用0.5mL硝酸溶液（5+95）溶解转移至刻度管中，用水定容至10mL，移取其中1.00mL样液于10mL容量瓶（或离心管）中，加水定容至刻度，即得待测液。

（三）原子吸收光谱测定

按照表1-5的条件设置参数，进行各溶液吸光度的测定。

五、数据记录与处理

1.将标准溶液及试液的原子吸收吸光度记录于表1-6，根据标准溶液的浓度和吸光度，进行线性拟合，得到标准曲线以及线性回归方程。

2.将样品溶液测定的吸光度值代入线性回归方程，计算样品测试液中钙的含量，并利用式（1-1）计算AD钙奶中钙的含量 X ，并与标示值（40mg/100mL~80mg/100mL）进行比较，给出相应的结论。

式中： X 为试样中钙的含量，单位为毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）; ρ 为试样待测液中钙的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）; ρ ₀ 为空白溶液中钙的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）; f 为试样消化液的稀释倍数； V 为试样消化液的定容体积，单位为毫升（mL）; m 为试样质量或移取体积，单位为克或毫升（g或mL）。

3.精密度评价：收集本班所有的测定结果 X ，计算平均值，并计算相对标准偏差和本组所做数据的偏差，对该方法的精密度做出评价。

六、注意事项

1.使用浓硝酸溶液和炭化时，需要在通风橱内进行。

2.炭化过程中注意防止烫伤。

3.在做灰化试验时，一定要先将样品在电炉上充分炭化至无烟后，再放入马弗炉中灰化，防止碳的积累损坏加热元件。

4.将炭化样品后的坩埚放入马弗炉时，一定要注意自己小组坩埚所放的位置，避免拿错。

5.马弗炉使用完毕，应切断电源，使其自然降温。不应立即打开炉门，以免炉膛突然受冷碎裂。如急用，可先开一条小缝，让其降温加快，待温度降至200℃以下时，方可打开炉门。

6.从马弗炉取出坩埚时应使用坩埚钳，防止烫伤。

七、思考与讨论

1.仔细阅读GB 5009.92—2016《食品安全国家标准 食品中钙的测定》，列出食品中测定钙含量的样品前处理方法，并比较其优缺点。

2.通过整个实验过程，你认为有哪些原因会产生误差？

参考文献

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中钙的测定:GB 5009.92—2016[S].北京:中国标准出版社,2016. ChAu6sUU+a9JNZgRS4whs/HGIt5yJ0D+ad4VtT/2jHjyxWssjJl4WR666RmupQwE