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全面抗战爆发后，董必武长期在国民党统治区工作，他“站在抗日民族统一战线的前卫地位”“不屈不挠地奋斗着”。
他协助周恩来工作，为抗日民族统一战线的形成和发展，以及国统区的党建工作做出了卓越贡献。
为加强在国民党统治区的工作，中共中央决定在西安、太原、上海、南京、武汉、长沙等地公开设立八路军办事处。同时，中共中央政治局常委会于1937年8月23日决定以派到国民党统治区工作的中共中央代表林伯渠、董必武、周恩来、秦邦宪、叶剑英组成中共长江沿岸委员会，由周恩来任书记，领导中共在长江一带和西安的工作。根据中共中央的指示，董必武以中共中央代表的身份，于1937年9月离开延安，经西安到武汉，恢复和开创中共在武汉地区的工作。
董必武协助周恩来谋划于武汉、南京、长沙之间，一面公开开展统战工作，筹建第十八集团军
武汉办事处和新华日报馆；一面秘密筹建中共湖北省工作委员会，改组中共鄂豫皖、湘鄂赣两省委，恢复和发展在第二次国内革命战争时期被破坏的中共组织，同时，还调整和补充中共领导的红军游击队，使高敬亭、
傅秋涛
两部均按红军规模加以扩充。到武汉后，董必武住在汉口府南一路安仁里1号，并在东方旅馆楼上租了一间房，接待各方面来访的客人，积极展开统战工作。
与此同时，董必武统一领导了同国民党武汉行营的谈判工作。10月，他顺利筹建了八路军武汉办事处，经与秦邦宪、叶剑英等商定，由李涛
（湘龄）任处长。他又通过谈判斗争，为高敬亭、傅秋涛两部红军游击队从军饷上和物资上向国民党当局争得了一定补充。因湘鄂赣省委不健全，董必武又和叶剑英在南京商定，将鄂豫皖省委改为特委，派郑位三
任书记，高敬亭为委员并负责军事工作；派李涛到傅秋涛部传达中共中央关于抗日民族统一战线的政策，将湘鄂赣省委也改为特委，傅秋涛任书记，党的组织由公开转为秘密。
董必武还亲赴黄冈、麻城、黄安等县，为人民抗日队伍募捐，进一步改善了部队的给养。10月2日，中共中央同国民党达成协议，将留在湘、赣、闽、粤、浙、鄂、豫、皖八省边境13个地区的红军游击队改编为国民革命军陆军新编第四军。董必武同周恩来、叶剑英、叶挺等就建立新四军等问题进行商议以后，又和叶剑英于次年初先后到黄安七里坪，检查高敬亭部改编为新四军第四支队并准备挺进敌后的情况。
在周恩来、叶剑英、董必武的具体关怀、筹划之下，高敬亭部发展到3 100余人，傅秋涛部发展到1 500余人，装备得到了一定的改善。从1938年2月开始，高、傅两部分别奔赴抗日前线，向皖中舒城、皖南岩寺地区集中，成为新四军的一支劲旅。
1937年11月12日，上海失陷，南京门户洞开，南京八路军办事处的部分工作人员随即迁往武汉；12月上旬，董必武、叶剑英即组织宁汉两地的八路军办事处合并，钱之光
任处长。中旬，中共中央政治局会议决定，由周恩来、王明、秦邦宪、叶剑英组成中共中央代表团，负责同国民党谈判；由周恩来、秦邦宪、项英、董必武组成中共中央长江局，领导中国共产党在中国南部的工作。
11月18日，周恩来、王明与秦邦宪从延安来到武汉，11月23日，代表团和长江局在武汉举行联席会议，决定两者合并，对外称中共中央代表团，对内为长江局，暂以王明为书记，周恩来为副书记，董必武兼长江局民运部部长，主管包括文教、青运、妇运、党派等在内的民运工作，兼管中共湖北省委的工作。
这一时期的董必武一方面积极恢复和发展了大革命失败后被国民党反动派破坏了的共产党组织；另一方面，又和张国焘、
王明等人的右倾错误路线展开了艰苦的斗争，重新甄别了一大批失联党员，向各类工青妇群团组织派驻了大量共产党员与进步青年骨干力量，在湖北开辟了大量坚实的农村敌后抗日根据地，利用各种机会与场合，宣扬共产党的正确理念与先进思想，不断扩大党的影响力。
在武汉期间，董必武支持潘梓年、
许涤新
创办《群众》周刊和《新华日报》，作为党的喉舌，宣传全民族抗日统一战线理论，鼓舞民众，与反动势力做舆论斗争；他还指导湖北省委在应城汤池、黄安七里坪、汉口富源里等地举办面向大专院校学生、党员、游击队员等各群体的各类训练班，进一步教育民众，为抗日斗争输送了一批新鲜血液。
1938年3—4月，在中共推动下，国民党临时全国代表大会决定成立国民参政会。6月16日，国民党中央常务委员会第81次会议决定1938年7月1日召开国民参政会，并公布了参政员名单。国民党政府聘请毛泽东、陈绍禹、
秦邦宪、林伯渠、吴玉章、董必武、邓颖超
7位中共人士为国民参政会参政员。7月6—15日，董必武作为中共参政员出席国民参政会首届会议，被指定为内政组召集人之一，并当选为驻会委员。在武汉期间，董必武遵循中共中央“明确的政治立场和诚挚的团结精神”
的指示，利用各种社会关系和一切可以利用的机会、场合，在会内、会外积极进行活动。
1938年10月初，在武汉沦陷之前，董必武率八路军办事处及《新华日报》编辑部迁往重庆。10月8日，《新华日报》重庆分馆举行茶会，欢迎中共参政员、《新华日报》董事会成员董必武。董必武发表了题为《目前抗战形势与〈新华日报〉》的讲话，批评了社会上弥散的消极、失败情绪，并勉励《新华日报》积极宣传党的政策与方针，宣传各民主党派和无党派人士有利于抗日民族统一战线的意见与主张。
在渝期间，面对复杂艰难的特殊政治形势，董必武不屈不挠，坚持以斗争求团结，尤其是在1939年12月国民党第一次反共高潮与1941年1月皖南事变发生后，董必武利用《新华日报》等媒介发布一系列文稿，揭露国民党当局的丑恶行径，宣讲中共的立场与主张，要求惩治激变首恶，呼吁团结一致、抵御外辱；他以国民参政会参政员的身份，坚持“议会斗争”，以提案、质询以及退席等方式与国民党顽固派周旋；他还积极展开会外活动，与国民党左派、各民主人士以及外国驻华使节宣讲、恳谈，使得社会各阶层人士对于中国共产党更加了解与同情，有效扩大了统一战线的范围。
值得一提的是，此时的董必武开始接触立法工作，以国民参政员的身份参与了国民政府的“立宪”。在重庆，董必武参与了“宪政座谈会”“宪政期成会”“宪政促进会”等一系列要求当局尽速“行宪”的活动。1940年4月1日，国民参政会一届五次会议召开，面对蒋介石当局抛出的“五五宪草”，董必武等中共参政员指出，所谓“五五宪草”是抗战前的东西，目前已不适用，现在需要的宪法应当根据抗日民族解放战争的具体状况和社会各抗日阶层力量的对比，以孙中山的新三民主义为原则重新制定，并提出了新的“中华民国宪法草案修正案”。
皖南事变之后，蒋介石当局加紧独裁阴谋，一方面，进一步限制中共生存的空间，妄图取缔国统区的八路军办事处；另一方面，开始打击、迫害监督民国政府和同情中共的民主人士。
董必武与周恩来等一道，遵照中共中央“充分地准备应付可能发生的任何地方性和全国性的突然事变”的指示，将在重庆工作的一些身份已公开、半公开的党员撤回延安，或转移到其他较安全的地方，把可能遭到国民党迫害的大批民主人士、进步分子、左翼文化人士从重庆、桂林转移到香港地区。邹韬奋、
张友渔、
夏衍、
胡绳、
韩幽桐
等就是这时被派到香港地区，由廖承志
联系并帮助他们开展工作的。完全没有暴露身份的党员，有的参加国民党政府设立的战地党政委员会，有的参加国民党的所谓训练团，在国民党政府军事委员会总政治部工作。董必武等人细致且有预见性的工作为中国抗日与解放事业保存了大量有生力量。
1945年4月，在世界反法西斯战争全面胜利前夕，由中、苏、美、英四国发起，在美国旧金山召开了《联合国家宣言》的签字国和参加国参加的“联合国国家国际组织会议”，会议的主要议案是制定并通过联合国宪章。会前就中国代表团的人员组成，国共双方展开了斗争。1945年3月，周恩来写信给国民党代表王世杰，
并通过已回国的美国驻华大使帕特里克·杰伊·赫尔利（Patrick Jay Hurley），
声明国民党独占参加旧金山会议代表的名额是不公正的、不合理的，中国共产党拟派周恩来、董必武、秦邦宪3人参加中国代表团。
国民党政府虽然没有接受中国共产党提出的全部条件，但表示同意董必武为出席旧金山会议的代表。3月27日，国民党政府行政院正式公布董必武为中国出席旧金山会议代表团的成员。同时公布的代表团成员有宋子文、
顾维钧、
王宠惠、
魏道明、
胡适、
吴贻芳、
李璜、
张君劢、
胡霖、
施肇基。
4月21日，董必武等与胡霖等同时飞抵纽约，24日到达旧金山。25日下午，旧金山会议正式开幕，董必武与中国代表团其他成员一道出席了大会。除参加大会外，董必武还出席了组织及程序第三小组委员会。5月1日，他参加我国出席联合国安全机构会议代表团举行的第一次记者招待会，回答了记者提出的问题。6月26日，会议闭幕，按照大会预定程序，参加会议的50个会员国的代表在《联合国宪章》上签字（加上后来签字的波兰为51国），董必武代表中国共产党和中国人民在联合国宪章上签字。当天，他向国内发表广播演说。
在美期间，董必武还积极展开了统战与侨务工作。公余，董必武瞻仰了旧金山孙中山先生铜像，会见了华侨代表，到华美协进会发表演讲，在纽约华侨衣馆联合会的会员大会上做报告，为该会以及华侨办的金星广播公司题词留念，向华侨发表了题为《中国共产党的基本政策》的演讲，还代表中国共产党捐助《华侨日报》10 000美元。此外，董必武还利用自身的影响力展开“民间外交”，诸如看望中国人民的老朋友、美国进步女作家艾格尼丝·史沫特莱（Agnes Smedley），
争取她的协助；会见美国部分上层人物、友好人士和新闻记者，介绍中国解放区的情况；他与章汉夫、
徐永瑛
一起编写了《中国解放区实录》一书，用英文印刷了5 000册发行，向全世界介绍了中国共产党领导下的解放区的真实情况，争取更多国际人士对于共产党的理解与同情。董必武此次美国之行，圆满完成了中共中央指示的各项任务。
回国后的董必武，又迅速回到了统战工作的前线。12月5日，周恩来向中共中央建议，将董必武去渝时改组的中共重庆工委恢复为中共中央南方局，由董必武任书记，王若飞
任副书记，刘少文、
徐冰、
华岗、
钱瑛、
钱之光、潘梓年、熊瑾玎
为委员，章汉夫、王世英、
童小鹏、
王炳南、
许涤新、张友渔、夏衍为候补委员，领导国统区工作；由周恩来、董必武、王若飞、陆定一、
叶剑英、吴玉章、邓颖超组成中共代表团，负责同国民党谈判和出席政治协商会议。中共中央于15日批准了这一提议，并确定南方局目前称为中共中央重庆局。董必武和他的战友们继续战斗在南中国的国统区。