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关于光绪之死，历来众说纷纭。1938年，光绪的陵墓遭盗掘。1980年，我国有关部门对光绪皇帝的棺椁进行清理并重新封闭，光绪的若干头发、遗骨与衣服被移出，保存在清西陵文物管理处的库房。
光绪皇帝陵墓
2003年，清西陵文物管理处等四家单位相关工作人员组成了一个课题组，研究者采集了光绪的两小绺头发，试图用现代科技破解这一百年疑案。
一系列实验和模拟实验表明，光绪的两小绺头发砷含量的最高值远远高于当代人，是光绪隆裕皇后的261倍，也远远高于其棺椁内物品和墓室内外环境样品的最高含砷量。在光绪遗留下来的三件较为完整的上衣中，胃部和腹部位有多处腐蚀脱落形成的窟窿。以上检测结果表明：大量的砷化合物曾留存于光绪帝尸体的胃腹部，尸体腐败过程中，这种剧毒化合物也四处扩散，并由里向外侵蚀衣物。由此可推知：光绪帝的骨骼、内层衣物及头发的高含量砷，均来自其尸体胃肠内含砷的物质。
光绪皇帝胃肠中致命的砷元素究竟来自哪种化合物呢？经过一系列分析、比较和小鼠实验，专家们得出的结论是：砒霜。
砒霜是一种剧毒化合物。人口服砒霜60~200毫克就会中毒死亡。因受条件限制，光绪帝尸体中的砒霜总量难以测算，但仅头发残渣中的砒霜总量就高达约201.5毫克。2008年11月3日，国家清史编纂委员会在北京举行光绪死因研究报告会，正式宣布光绪死于急性砒霜中毒。
由此来看，光绪皇帝是被人毒死的，那么到底是谁毒死了光绪皇帝呢？根据历来人们的猜测和论断，大致有以下几种说法。
很多人说第一作案嫌疑人是袁世凯，这不无道理。因为光绪皇帝生前最恨的人恐怕就是袁世凯。据夏仁虎《旧京琐记》中说：戊戌政变之后，光绪皇帝被囚禁在瀛台，“日书项城（即袁世凯，因其为河南项城人，故称袁项城）名以志其愤”。光绪临死之前，在纸上写了几个字，私下递给隆裕，上面写着：“杀余者某人。”这个“某人”就是袁世凯，所以，隆裕亲政后，第一件事就是罢免了袁世凯。还有的史料说，光绪常常画一个小人儿，写上袁世凯的名字，然后用箭来射，以此解闷消恨。
光绪为什么这么痛恨袁世凯呢？因为正是袁世凯的告密，导致了变法的失败。本来，慈禧是赞同变法的。她将国家大权交给光绪之后，自己便在颐和园里专心致志地从事戏剧改革——将宫廷大戏《昭代箫韶》由昆曲翻改成皮黄（即后来的京剧）。随着变法的一步步深入，一些衙门被裁撤，一些官员被罢免，这些官员——礼部尚书怀塔布、许应骙，侍郎堃岫、徐会澧、溥颋、曾广汉等，便到慈禧太后那里去告状、诉苦。
袁世凯像
据说，慈禧太后听了这些诉苦之后并没有表态。但是光绪皇帝很紧张，害怕太后回京阻挠变法，于是紧急召见袁世凯，给了他一道圣旨，要他回天津，将直隶总督荣禄正法，然后带兵进京，包围颐和园，不许任何人进出。（美国传教士何德兰：《慈禧与光绪皇帝》）根据陈夔龙《梦蕉亭杂记》中所记，袁世凯当时就向皇帝表示，天津尚有聂士成的军队，兵力比袁世凯的新建陆军多数倍，所以带兵围颐和园之事，“万不敢办”；传旨将荣禄正法，“亦恐办不到”，只答应到九月两宫赴京阅兵时，找机会下手。
袁世凯回到天津之后，把圣旨呈给了他的顶头上司荣禄。荣禄连夜进京，会晤庆亲王、觐见慈禧，“均各愕然”。于是，慈禧回京“训政”，光绪被囚瀛台，康、梁亡命海外，六君子断首菜市口，变法宣告失败——在光绪皇帝看来，袁世凯是造成这一后果的第一号罪魁。
平心而论，造成这一后果的，应该是光绪本人。首先，他的变法步子迈得过大且过急，缺乏社会基础；其次，他没有和慈禧及时沟通——无论怎么说，在政治上慈禧要比他老练得多、经验丰富得多；最后，他用人有问题，尤其是错误地信任了袁世凯。
袁世凯也知道光绪特别恨他。因此他非常害怕慈禧宾天之后光绪重新执政会杀了他。所以，他确实想先下手，害死光绪。刘禺生的《世载堂杂忆》中说，袁世凯身边有个智囊名叫杨杏城，给袁世凯出主意：商之李莲英，毒死光绪皇帝。果然，慈禧病危，光绪反倒先死了。
从这一点来说，光绪被毒杀，袁世凯当然是第一个“嫌犯”，因为他有“作案动机”。但还有好多人比他的作案嫌疑大得多。比如李莲英。
据《清室外记》记载：“皇帝殡天之情形及其得病之由，外人无由详知，唯藏于李莲英辈之心中。关于太后、皇帝同时而崩，北京城中，言人人殊，然欲查其原因，则实毫无线索。但日处忧城之中帝，一旦再操大柄，自为李莲英辈之不利。所以可以断言，当日颐和园中之事，或为太后所不及知者。据当时目击者论之，此亦情势所可有。”
这段话是说慈禧太后的亲信太监李莲英等人，平日里狗仗主势，经常中伤和捉弄光绪帝。他们怕在西太后死后光绪再操权柄，会不利于他们，所以就先下手为强，在西太后将死之前，先将光绪帝害死。这一说法同时为英国人普兰德所著的《慈禧外传》和德龄所写的《瀛台泣血记》等书所认同。
德龄以亲身经历认定光绪皇帝就是被李莲英害死的。她的书中写道：“李莲英眼看太后的寿命已经不久，自己的靠山快要发生问题了，便暗自着急起来。他想与其待光绪掌了权和自己算账，不如让自己先下手的好。经过几度筹思，他的毒计便决定了。”
书中写道：“近来奴婢听许多人说，万岁爷的身子很不好”……“奴婢愿意瞧瞧他看，或者可以使他的身体好起来。”……“就在李莲英说过这一番话的第二天，光绪便好端端地也害起很厉害的病来。……只有光绪自己心里是明白的，他料定必是被李莲英在饮食里下了毒，存心要谋杀他。”
李莲英像
但李莲英那时已垂垂老矣，时日无多，纵然光绪将来得势，又能把他治成什么样呢？况且李莲英平时对待光绪也不是一直都苛刻，也有对他不错的时候，所以他虽有嫌疑，但也不是很大，有最大嫌疑的，其实就是一直控制光绪皇帝的人——慈禧太后。