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第四节
苗药药代动力学研究的生物样本前处理技术

生物样本前处理是苗药药代动力学研究的重要组成部分,也是生物样本分析中最困难、最烦琐的工作之一。苗药药代动力学研究采集的生物样本通常包括体液(全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、胃液、胰液、胆汁等)和组织器官(心、肝、脾、肺、肾、胃肠道、生殖腺、脑、骨骼肌等)。由于生物样品内源性基质干扰严重,待测原型成分及代谢产物的复杂性,因此在对生物样品待测成分进行定性和定量分析过程中,样品前处理是影响检测结果的关键一步。生物样本的前处理技术主要包括提取、分离与富集,以达到提高分析灵敏度和准确度,同时降低基质干扰,获得最佳分析性能的目的。理想的样品前处理技术应该符合以下条件:①能够选择性并高效率地分离出复杂基质中的待测物;②能够有效去除共存的干扰组分,不会损害或干扰分析检测系统;③通过调节样品的酸碱度、离子强度、浓度等,满足检测仪器的工作要求;④操作简便、方法可靠,且具有可重复性。建立快速、高效、实时的生物样本前处理方法也一直是体内药物分析的关键与热点。

一、蛋白沉淀法(protein precipitation,PPT)

PPT是基于有机溶剂、强酸、强碱等化学试剂使蛋白质变性的原理,向待提取的样本中加入化学试剂,经高速离心沉降后,目标物处于上清液,从而达到分离的目的。常用的有机溶剂包括乙腈、甲醇、乙醇和丙酮等。将不同有机溶剂按不同比例混合能够影响生物样本中蛋白的变性和沉淀过程,从而影响化合物的提取回收率。PPT的主要优点是操作简便易行,无须特殊装置,适合于大批量样本处理。其主要缺点是待测物随基质蛋白质共同沉淀而损失,基质中的磷脂类干扰物不能完全去除,而干扰物的存在会产生离子抑制或离子增强作用,导致分析结果重现性差。

二、液液萃取法(liquid-liquid extraction,LLE)

LLE是利用待测目标物在两种不混溶的溶剂中的溶解度或者分配系数不同,经过充分混合并反复萃取后,将其从一相中提取至另一相的溶剂中而实现分离提取目标化合物的目的。LLE的主要优点是操作简便、容易掌握和成本低廉。其主要缺点是操作烦琐费时,有机溶剂消耗量大;容易发生乳化现象,对分析物的回收造成负面影响;不适用于亲水性化合物。LLE的改良技术有硅藻土液液萃取、液液微萃取、加速溶剂萃取及盐析辅助液液萃取等新型液液萃取技术等。

三、固相萃取法(solid-phase extraction,SPE)

SPE是基于目标化合物在固定相和流动相之间分配系数的差异,以固定相作为提取剂并选择性吸附目标物,实现与基质的分离,再利用流动相将目标物选择性地从固定相上洗脱下来,从而达到分离的目的。SPE多采用商品化的固相萃取小柱,其按所用填料主要分为反相填料(C 4 、C 8 、C 18 和Phenyl)、正相填料(Si-CN、Si-NH 2 和Si-Diol)、离子交换填料(Si-WAX、Si-SAX、Si-SCX和Si-WCX)和混合型填料(分子印迹聚合物和分子印迹膜)。一般需依据分析物的极性、溶解度、解离常数(p K a )等理化性质选择合适的固相萃取柱。SPE的主要优点是萃取效率高,可实现样本富集,基质效应少,分析灵敏度高,样本用量少,有机溶剂消耗少,操作简单,易于实现自动化处理。其主要缺点是分析成本高,萃取小柱易被样品堵塞,柱子的载样量有限,不同特性的化合物需要使用含不同填料的萃取小柱等。

四、微透析技术(microdialysis)

微透析作为一种实时、在线、活体、微量、微创的取样技术,能够准确地实时监测靶器官和组织中外源性或内源性物质的动态变化,着手于靶部位研究,为药动学提供更为真实可靠的实验数据。它是结合灌流和透析原理的取样技术。其原理为非平衡状态下组织间隙中待测化合物顺浓度梯度经透析膜扩散到埋植在组织中的微透析探针中,然后进入透析液并随着透析液被连续不断地带出,从而达到活体取样的目的。再运用冷冻自动收集装置以一定的时间间隔收集透析液,采用高灵敏度微量化学分析技术对透析液中的成分进行定量分析。微透析广泛用于体内外活性物质的连续监测,越来越多地被用于脑、血液、心脏、肺、肝脏、肾脏、皮肤、肌肉、脂肪及关节等外周组织活性物质的监测。微透析具有连续采样、动态观察、定量分析、样本少、组织潜在损伤小等优点,而这同时也降低了实验动物的体液损失及动物个体差异对结果的干扰。但微透析导致样本容量小、样本组成复杂和分析物浓度极低也是该技术面临的主要挑战。 l10ihYnef/BwAX8wXOi//2UcOt8o2kfF9Ro5jMpjqLrdimXrwigu88phOzS8ghYX

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