下载掌阅APP，畅读海量书库
立即打开
由于苗药成分的复杂性及对药效物质认识尚不充分，加之目标成分在生物样本中浓度低、内源性基质和目标成分之间干扰大及其代谢成分复杂，其药代动力学研究存在诸多困难，因而需要建立分离效能高、灵敏度高、选择性好的分析技术。生物样品的定性和定量分析方法主要有色谱法、光谱法、免疫分析法、微生物测定法、电化学分析法等。近年来，随着现代分析技术的快速发展，液质联用分析技术已能整合液相色谱技术的高分离能力和质谱检测技术的高特异性、高灵敏性，并成为苗药药代动力学研究强有力的分析工具。
液质联用技术（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）起源于20世纪70年代，以液相色谱中色谱柱实现化合物分离，质谱作为检测器对化合物进行定性表征。液相色谱具有适用性好、成分分离度高的特点，质谱检测器具有专属性强、灵敏度高、检测限低的特点，两者联合使用不仅结合了两者的优点，更使得两者结合之后的检测器对化合物的表征和鉴别更加科学、合理、高效、快速。
质谱检测器对能检测到的待测化合物须是气相离子。待测物的气雾状态是对化合物定性或定量的前提条件。质谱检测器根据待测物的极性大小可分为两种，一是正离子模式，二是负离子模式。一般负离子模式常用于偏酸性的物质，如多羟基、羧酸等易失去电子显弱酸性的化合物；正离子模式常用于分析偏碱性的物质，如生物碱类化合物。根据待测化合物的性质，可以选择不同的离子化方式，使待测化合物生成气态正离子或负离子，然后进行质谱分析。
1.电喷雾电离（ESI） ESI属于一种软电离技术，其电离过程是离子雾化。当待测样品的溶液通过毛细管进入雾化室，喷雾器顶端会施加一个电场给微滴提供净电荷。在高电场下，液滴表面被破坏，裂变成微滴，随着荷电微滴中溶剂的蒸发，微滴表面的离子“蒸发”到气相中，进入质谱仪。即便是分子量大、稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解。ESI普遍用于肽类、蛋白、糖类和寡核苷酸的分析，适用性较其他离子源广泛。虽然ESI技术应用较为广泛，却易受高浓度缓冲液（盐），或其他内源性杂质干扰，且易吸附在离子源内部，不易排出，从而导致灵敏度降低。
2.大气压化学电离（APCI） 在APCI源中，待测样品溶液在高速气流辅助下雾化形成液滴，然后被载入加热室。溶剂和样品受热气化，溶剂离子与被测物发生分子-离子反应，通过质子转移反应使样品离子化。在APCI中电离主要发生在气相，而在ESI中电离发生在溶液中。由于电晕放电产生远远过量的气相溶剂离子，气相中分子-离子反应程度较低，所以认为APCI受离子抑制效应的影响较小，通常能比ESI提供更宽的线性范围。与常规ESI的流速（0.1～0.5mL/min）相比，APCI使用更高的流速（1～2mL/min），从而产生大量的溶剂离子，使离子/分子电荷转移所需要的碰撞频率最大化。由于需要受热脱溶剂，APCI与ESI相比，它的优点是流动相的适应范围更广，主要用于分析热稳定性好的样品，不太适合极性强的大分子（分子量＞1000Da）样品，因为这些分子容易受热分解。
3.大气压光电离（APPI） APPI作为一种新型的LC-MS离子化技术，适用于ESI和APCI不适宜的分析物。由于ESI和APCI的软电离机制，它们对极性化合物有良好的响应，但对非极性或弱极性化合物的响应较低。APPI在大气压下使用加热喷雾器（300～500℃）使流动相蒸发，将所得的气体穿过放电灯（UV光源）产生的光子束。该放电灯发射的光子能与被分析物气体分子发生相互作用而发生电离化，离子被引入质谱仪进行检测。APPI的另一特性就是，其受磷酸缓冲盐和表面活性剂的干扰很小，扩展延伸了LC-MS技术的应用领域。
4.解吸电喷雾电离（DESI） DESI兼有电喷雾电离（ESI）和其他解吸电离（DI）技术的特点，是一项新型的质谱离子化技术。DESI的样品离子化是带电液滴的喷雾指向感兴趣化合物的表面，在这个表面上有机小分子和生物大分子被解吸和电离。DESI可使碎片最少，形成完整无损的分子离子。与其他解吸离子化方法相比，DESI的主要优势在于不需要样品预处理，而且可以在一般环境下操作，可从各种分析物表面直接获得化学信息。
质量分析器是依据不同方式将离子源中生成的样品离子按质荷比（ m/z ）的大小分开并排列成谱的仪器，位于离子源和检测器之间，是质谱仪的重要组成部件。由于不同类型的质谱仪器有不同的原理、功能、指标、应用范围，因而有必要了解各种质谱分析器的特点。目前，常见的质量分析器包括四极杆质量分析器、离子阱质量分析器、傅里叶变换离子回旋共振，以及飞行时间质量分析器。
1.四级杆质量分析器（QMS） 四级杆质量分析器是目前最成熟、应用最广泛的质量分析器之一，包括四个电极，理论上为双曲面四级杆，由四根精密加工的电极杆，以及分别施加于 x 、 y 方向的两组高压高频射频组成的电场分析器。四级杆质量分析器中离子的分离是以特定的 m/z 值的离子获得稳定轨道为基础的。高压高频信号提供了离子在分析器中运动的辅助能量。这一能量是具有选择性的——只有符合一定数学条件的离子才能够不被无限制地加速，从而安全地通过四极杆分析器。由于四极滤质器结构紧凑、体积小、扫描速度快、分辨率较高，适用于色谱-质谱联用仪器。
2.离子阱质量分析器（IT） 离子阱质量分析器一般由一个环形电极和上下两个呈双曲面的端盖电极围成一个离子捕集室。某一质量的离子在一定的电压下可以处在稳定区，留在阱内。改变电压后，离子可能处于不稳定区，振幅很快增长，撞击到电极即消失。在直流电压和射频电压比值不变时用射频电压扫描，即可以将离子从阱内引出获取质谱信号。离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度，分析质量范围大，可以分析质荷比高达数千的离子，同时单个离子阱通过期间序列的设定就可以实现多级质谱的功能。
3.傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR） FT-ICR是一种根据给定磁场中的离子回旋频率来测量离子质荷比（ m/z ）的质谱分析器。通过傅里叶变换，可以从信号数据中获取有用的信号形成质谱。FT-ICR质谱仪分辨率极高，且具有灵敏度高、质量范围宽、速度快、性能可靠等优点。其分辨率可达到极微小，灵敏度可达皮克级别，较其他质谱检测器更准确可靠，可完成多级串联质谱的操作。尽管FT-ICR MS具有超高的分辨率，可提供高分辨的数据而使信息量更丰富，但是它的工作环境需要强磁场，且占地面积大，并通常需要长时间的优化和扫描，费用也较高，这些都限制了FT-ICR的发展和应用。
4.飞行时间质量分析器（TOF） TOF的原理是不同 m/z 值的离子在相同的动能下加速，离开离子源和进入无场飞行管之后获得的运动速度不同，因此每个离子穿越飞行管所需要的时间（ t ）不同。高质量离子到达检测器所需的时间将比低质量离子所需的时间长。 m/z 最小的离子具有最快的速度因而首先到达离子检测器， m/z 最大的离子则最后到达离子检测器。TOF为高专属性、高灵敏度的高分辨质谱，具有较大的质量分析范围，得到的质谱图信息丰富。TOF的主要缺点是分辨率随着分子量增加而降低，质量越大，飞行时间差越小，分辨率越低。
串联质谱仪采用二级质量分析，第一级用于预选离子，第二级用于分析有惰性气体碰撞活化而生成的产物离子。这种双重分析可以是空间串联或者是时间串联。空间串联是由两个物理上分开的质量分析器构成，代表性的包括由磁场部分和供电部分组成的两扇面仪器、三重四级杆仪器，或杂合串联仪器。时间上串联可以通过捕获设备，如傅里叶变换离子回旋共振和离子阱来实现。在内部储存离子通过排出所有其他离子来选择所关注的离子，选择的离子在选定时间内被激发和裂解，对产物离子进行质量分析。其获得离子的过程可以重复进行，因此能够进行MS n 实验。其中三重四级杆质谱仪（QqQ-MS）、四级杆-飞行时间串联质谱仪（Q-TOF-MS）、四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（Q-Orbitrap-MS）、离子淌度质谱仪（IM-MS）在化学成分定性、定量方面具有独特优势。
1.三重四级杆质谱仪（QqQ-MS） QqQ-MS通过将样品在离子源打碎获得特异性子离子，子离子通过q1、q2、q3的选择后在接收器上转化为电信号，反映到分析软件就是离子强度。在一定线性范围内，分析物浓度越高，打到接收器上的离子就越多，信号越强，从而确定分析物的含量。QqQ-MS主要用于复杂基质中低含量化合物的定量分析，具有高灵敏度、高通量的特点。
2.四级杆-飞行时间串联质谱仪（Q-TOF-MS） Q-TOF-MS是一种可以同时定性定量的质谱，以其高灵敏度、高选择性、高精密度、高信息采集速度，以及能够产生多级质谱，获得化合物的元素组成和结构信息等优点，在中药化学成分定性方面有很大的优势。Q-TOF的出现有效地解决了药物现代化分析中组分复杂、定量困难等问题。但Q-TOF只能形成二级碎片，对于未知结构化合物的解析尚有不足；且离子源更换麻烦，配套的液相系统问题较多。因此，Q-TOF 技术未来发展应注重改善其质量稳定性，更好发挥其定性分析的优势。
3.四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（Q-Orbitrap-MS） Q-Orbitrap-MS是基于傅里叶变换的混合仪器之一，其中第一台质量分析仪是四极杆，第二台是高分辨率轨道阱。Orbitrap-MS可以将高性能的四极前驱物选择与高分辨率精确质量（HR/AM）Orbitrap检测结合起来，前体离子可以通过引入高能碰撞解离（HCD）而离解。其优势为分离效率高、扫描速度快，可在高分辨率下和很宽的质量范围内进行MS全扫描，定性筛选和基于全扫描的定量分析，以及高分辨率下的MS/MS全扫描，精确地采集母离子质核比和碎片离子质量数，能够同时进行定性和定量试验，有利于化学成分的鉴定，并针对复杂基质中痕量组分的高灵敏度定量分析。
4.离子淌度质谱仪（IM-MS） IM-MS是离子淌度分离与质谱联用的一种新型二维质谱分析技术。离子淌度分离原理是基于离子在飘移管中与缓冲气体碰撞时的碰撞截面不同，不同离子的形状和大小不同，离子按淌度预分离后，再通过每一组分质荷比求得质量数，便可获得离子淌度质谱二维图谱或三维图谱。IM-MS可提供离子结构信息和精确的质量信息，增强定性分析的能力，在区分异构体或复合物方面具有独特优势。