第四节
药代动力学研究

本实验以松脂醇单葡萄糖苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、原儿茶酸为指标成分，研究大鼠口服杜仲提取物后其体内的药动学特征，以阐释杜仲提取物的体内药效物质基础，为杜仲的进一步研究开发奠定基础。

一、杜仲提取物的制备方法

取杜仲药材（1～3cm），加10倍量水煎煮3次，每次2h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.05～1.07（50℃），加乙醇至溶液含醇量为65%，搅拌均匀，静置12h，抽滤，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.04～1.06（50℃），用1/2倍量水饱和的正丁醇萃取4次，减压回收正丁醇至相对密度1.04～1.06（50℃），上D101大孔树脂（15kg，8cm，径高比1∶6），用40%乙醇洗脱（洗脱流速1.5BV/h），收集流穿液和洗脱液，回收乙醇，残留物真空干燥，得杜仲提取物，得膏率为2.1%。

二、色谱条件

Waters BEH C 18 色谱柱（2.1mm×50mm，1.7µm），Waters Van Guard BEH C 18 保护柱（2.1mm×5mm，1.7µm），流速0.35mL/min，柱温45℃，流动相为0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱，进样体积为2µL。液相梯度见表4-8。

三、质谱条件

采用电喷雾电离源，毛细管电离电压3kV，离子源温度120℃；喷雾气与反吹气为氮气，去溶剂气流速650L/h，去溶剂气温度350℃；扫描方式为选择性离子监测（SIR）。京尼平苷酸等5种成分及内标用于定量分析的监测离子见表4-9。

四、血浆样品处理方法

取大鼠血浆100µL，置于1.5mL塑料离心管中，补加20µL甲醇，依次加入0.2µg/mL内标溶液10µL，1%甲酸50µL，甲醇400µL，涡混1min，超声5min，4℃、15000rpm离心10min，取上清液置于离心管中，40℃下氮气吹干，残留物加入200µL甲醇溶解，超声10min，涡混1min，4℃、15000rpm离心10min，取上清液进样UPLC-MS/MS分析。

五、实验方案与样品检测

健康SD大鼠6只，雄雌兼用，体重为220±20g，口服给药剂量为4.8g/kg，给药前12h禁食，自由饮水。给大鼠腹腔灌胃杜仲提取物溶液，并于给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、3.5、5、7、9、11、13、24、30h经尾静脉取血约0.4mL，然后分别置于均匀涂有肝素的塑料离心管中，4500rpm离心8min，分离血浆于-20℃冰箱中保存，备用。

样品测定方法按血浆样品处理方法进行处理，每批次生物样品测定随行标准曲线。在每批测定时随行测定低、中、高三个浓度的质控样品（QC），每个浓度的QC样品进行双样本分析，质控样品的测定数不少于样品总量的5%。根据每一批分析的标准曲线计算QC样品和未知样品的浓度。上述QC样品中最多允许两个不同浓度的样品超出理论值的15%，否则此批数据不被接受。

六、药物代谢动力学数据处理

采用DAS 2.0数据处理软件进行药物代谢动力学参数计算和数据拟合，选取最小AIC值拟合房室模型， AUC 0→t 、 MRT 等参数选用统计矩方法计算。

七、UPLC-MS/MS分析方法的确证

（一）专属性

在选定的色谱条件和质谱条件下，京尼平苷酸、原儿茶酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷5种成分及内标葛根素监测离子反应分别为 m/z 373.2、 m/z 152.9、 m/z 353.1、 m/z 681.3、 m/z 519.3、 m/z 417.0。空白血浆、空白血浆加京尼平苷酸等5种成分和大鼠给药后血浆样品色谱图见图4-8。京尼平苷酸等5种成分及内标的保留时间分别为0.98、1.07、1.46、2.38、3.71和1.81min，各成分间分离良好，未见杂质干扰。

（二）线性范围和灵敏度

大鼠血浆中京尼平苷酸等5种成分在其线性范围内线性关系良好，各成分标准曲线相关系数（ r ）均大于0.99。典型大鼠标准曲线和最低检测限（LLOD）见表4-10。

（三）准确度和精密度

通过对低、中、高三个浓度大鼠血浆的日内、日间精密度进行考察，结果显示京尼平苷酸等5种成分日内和日间精密度 RSD （%）均小于20%，准确度范围为90.4%～111%，提示该方法可靠、准确、重现性好。测定结果见表4-11、4-12、4-13。

（四）提取回收率

通过对京尼平苷酸等5种成分线性范围内低、中、高三个浓度的血浆样品提取回收率进行考察，结果显示5种成分的回收率分别为93.82%～102.31%，84.35%～97.60%、93.35%～102.20%、90.89%～95.37%、85.26%～98.22%。具体结果见表4-14。

（五）样品稳定性

通过对京尼平苷酸等5种成分低、中、高三个浓度处理后的血浆样品在自动进样器0h、6h的稳定性（ n =3）进行考察，结果表明京尼平苷酸等5种成分的处理后血浆样品在自动进样器中0h、6h均很稳定，具体结果见表4-15。

通过对京尼平苷酸等5种成分低、中、高三个浓度血浆样品分别在室温（约20℃）下放置6h、4℃下冷藏8h，以及冻融3次的稳定性（ n =3）进行考察，结果表明5种成分血浆样品在室温下放置6h、4℃下冷藏8h，以及经3次冻融循环均很稳定，具体结果见表4-16。

八、大鼠给药后血浆浓度及药物代谢动力学参数

大鼠口服杜仲提取物后，京尼平苷酸等5种成分的血液浓度见表4-17，平均血药浓度-时间曲线见图4-9。采用DAS 2.0软件计算药物代谢动力学参数并对药物在大鼠体内的代谢动力学过程进行房室模型拟合并，同时计算其相关药物代谢动力学参数（表4-18、4-19）。

九、讨论

HPLC-MS/MS技术兼具液相和质谱分离度高、选择性好双重优点，已成为当前研究体内药物分析的首选方法。超高效液相色谱（UPLC）对复杂样品具有的超强分离能力、超快分析速度、超高分析灵敏度，能够极大地提高分析工作的质量和效率，尤其是与质谱联用后更能凸显其优越性能。

在选择样品前处理方法时，本实验根据被测化合物的溶解性及极性分别考察了甲醇、乙腈、乙醇等沉淀蛋白，结果发现用甲醇的沉淀效果更好且无内源物质干扰。本实验还对是否进行有机溶剂（如乙酸乙酯、正丁醇、乙醚等）的萃取进行考察，得出此方法虽然可以得到较干净的样品，但回收率不稳定。血浆的前处理是药动学研究的重要步骤之一，同时也是关系到样品的测定结果的准确性。由于实验样品量较大，因此更简单的前处理过程能够缩短实验周期、提高实验效率，所以前期实验选择甲醇沉淀蛋白然后直接进样的方法，但在后续实验中却发现处理后的样品在-20℃冰箱冷冻保存时会变得浑浊。综合考虑色谱柱使用寿命等因素后本实验改为甲醇沉淀蛋白后用N 2 吹干，再经甲醇复溶后放于-20℃冰箱中保存，结果未发现沉淀。分析原因可能是首次甲醇沉淀蛋白不完全，吹干后用甲醇二次复溶相当于第二次沉淀蛋白，避免了未除净的蛋白在冷冻时发生胶状凝结的现象。

大鼠口服杜仲提取物后，5种成分能够较为快速地进入体内，其中京尼平苷酸在体内符合单室药动学模型，其余四种成分在体内均符合多室药动学模型。松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、原儿茶酸、绿原酸在0.5h左右即达到峰值，京尼平苷酸较长，需要8h。结果说明，大鼠口服杜仲提取物后前四种成分能够较为快速地进入体内，吸收和分布迅速，京尼平苷酸在体内吸收分布稍慢。京尼平苷酸等5种成分的平均滞留时间分别为9.356±1.314h、7.746±0.443h、3.82±0.647h、2.619±0.581h、2.453±0.344h。京尼平苷酸、原儿茶酸的滞留时间较长，说明其在体内消除较慢；而其他3种成分在体内滞留时间较短，说明其在体内消除较快。原儿茶酸与其他四种成分相比， AUC 、 C max 值相对较小，说明其在体内吸收较差。药动学参数表明，同一提取物中不同类别成分药动学参数存在一定差异，可能原因是口服给药后药物需要经胃肠道吸收后才能入血，药物中不同成分在胃肠的吸收特征不同，影响了其在体内的暴露特征，从而对药物的动力学参数产生了影响。 bUvO2lPYV0rgbv+mkVtNdjhxSl5HkMalzxjoO9YbM+U2qE+NUlFA37w4wXJ9Pcyx