第三节
吸收研究

一、杜仲提取物在Caco-2细胞的吸收特性研究

（一）杜仲提取物的制备

取杜仲药材（1～3cm），加10倍量水煎煮3次，每次2h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.05～1.07（50℃），加乙醇至溶液含醇量65%，搅拌均匀，静置12h，抽滤，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.04～1.06（50℃），用1/2倍量水饱和的正丁醇萃取4次，减压回收正丁醇至相对密度1.04～1.06（50℃），上D101大孔树脂（15kg，8cm，径高比1∶6），用40%乙醇洗脱（洗脱流速1.5BV/h），收集流穿液和洗脱液，回收乙醇，残留物真空干燥，得杜仲提取物，得膏率为2.1%。

（二）实验方法

运用Caco-2细胞模型考察杜仲提取物中京尼平苷酸、原儿茶酸、松脂醇单葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷的摄取特点，并以此为基础考察不同温度、浓度、pH及时间对可被吸收成分吸收的影响，以期为杜仲提取物的制剂研发提供一定的科学依据。

1.色谱条件 Waters BEH C 18 色谱柱（2.1mm×50mm，1.7µm）；Waters Van Guard BEH C 18 保护柱（2.1mm×5mm，1.7µm）。洗脱梯度：0～0.5min，5%～10%（A）；0.5～3.5min，10%～20%（A）；3.5～4min，20%～90%（A）；4～5min，90%～5%（A）。流速0.35mL/min，柱温45℃，进样器温度15℃，进样体积2µL。

2.质谱条件 Waters Acquity TQD质谱仪，MassLynx V4.1工作站，电喷雾电离源；毛细管电压3kV；离子源温度120℃；去溶剂气温度350℃；去溶剂气（氮气）流速650L/h；碰撞气（氩气）流速0.16mL/min；扫描方式为选择离子监测模式（SIR）。京尼平苷酸等四种成分及内标用于定量分析的监测离子见表4-2。

（三）杜仲提取物在Caco-2细胞的摄取特性

1.Caco-2细胞的培养 Caco-2细胞株，传代数在50代以内。将细胞接种于含10%胎牛血清的培养液（含3.7g/L NaHCO 3 ，1%L-谷氨酰胺及105U/L青霉素-链霉素双抗液）中，置于5% CO 2 、37℃培养箱中。待细胞生长融合约80%贴壁时，采用0.25%胰蛋白酶消化，细胞按10×10 4 /cm 2 接种于6孔培养板，接种24h后更换培养液，以后隔天更换1次培养液，1周后每天换液1次，细胞培养14d后，测定细胞跨膜电阻值为300Ω/cm 2 ，细胞单层膜形成后给药。

2.细胞摄取影响因素考察 将培养14d的细胞用37℃、pH值为7.4的HBSS缓冲溶液在培养箱中培养20min后，吸去缓冲溶液。用HBSS缓冲溶液轻轻冲洗两遍，洗去细胞单分子层表面的杂质。加入含药的HBSS溶液1mL，置37℃的培养箱中，分别考察不同培养时间（15、30、60、90、120、180min）、不同浓度（0.2、0.5、1、2、5mg/mL）、培养介质不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、不同温度（4、25、37℃），以及不同P-gp抑制剂（环孢菌素A、维拉帕米）对杜仲提取物细胞摄取的影响。

3.样品处理 取300μL细胞悬液，加入300μL甲醇沉淀蛋白，涡混2min，15000rpm离心10min，取2μL上清液进样分析，测定京尼平苷酸、原儿茶酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇单葡萄糖苷的浓度。另取10μL细胞悬液，以考马斯亮蓝法测定蛋白含量，摄取量以mg（药物）/g（蛋白）表示。

4.统计分析 统计分析所得数据以 ± s 表示，组间差异比较用t检验， P ＜0.05有统计学意义。

（四）不同浓度杜仲提取物对Caco-2细胞的毒性

选取对数生长期的Caco-2细胞，以每孔100μL，（10～20）×10 4 /cm 2 接种于96孔培养板中，将培养板置于37℃、5% CO 2 培养箱中孵育48h。实验分为正常对照组、药物组。正常对照组每孔加入100μL DMEM培养液；药物组将杜仲提取物稀释至不同浓度（0.5、5、10、20、40mg/mL），每孔加入100μL，4h后用MTT法检测。抑制率（%）=（对照组OD-实验组OD）/对照组OD×100%。每个浓度平行5孔，实验重复3次。结果（图4-3）显示，在所设置的浓度范围内，随着浓度的增加，杜仲提取物对Caco-2细胞的生长具有抑制作用，表明提取物浓度在5mg/mL以上时有细胞毒性（ P ＜0.05），因此选择5mg/mL以下浓度进行下一步的摄取实验。

（五）不同浓度对Caco-2细胞摄取的影响

分别加入杜仲提取物的Hank's溶液（0.2、0.5、1、2.5、5mg/mL）2mL，按“样品处理方法”项下分析，计算摄取量。在浓度为0.2～5mg/mL的杜仲提取物中，京尼平苷酸、原儿茶酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇单葡萄糖苷4种成分的细胞摄取量与浓度呈线性关系，回归方程分别为 y =0.051 x -0.016， r 2 =0.9941； y =0.040 x +0.018， r 2 =0.9916； y =0.082 x -0.055， r 2 =0.9989； y =0.029 x +0.033， r 2 =0.998。结果（图4-4）表明，京尼平苷酸等4种成分的摄取主要表现为被动扩散。

（六）不同时间对Caco-2细胞摄取的影响

将杜仲提取物（5mg/mL）加入培养好的细胞中，分别考察不同时间（15、30、60、90、120、180min）对Caco-2细胞摄取杜仲提取物的影响。结果（图4-5）显示，在不同的摄取时间下，杜仲提取物中京尼平苷酸、原儿茶酸、松脂醇二葡萄糖苷3种成分的细胞摄取量随着时间的增加而增加，松脂醇单葡萄糖苷随着时间的增加而降低。

（七）不同pH值对Caco-2细胞摄取的影响

将杜仲提取物（5mg/mL）分别溶于不同pH值（4、5、6、7、8）的Hank's溶液中，分别在加药60min后测定不同pH值对Caco-2细胞摄取杜仲提取物的影响。结果（图4-6）显示，在pH值4、5、6、7、8条件下，杜仲提取物中京尼平苷酸、原儿茶酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇单葡萄糖苷4种成分的细胞摄取量随pH值的增加而逐渐降低，表明酸性环境相对有利于京尼平苷酸等4种成分的吸收。考虑到小肠的吸收环境，因此选择pH值6作为后续实验的pH环境。

（八）不同温度对Caco-2细胞摄取的影响

将杜仲提取物（5mg/mL）加入培养好的细胞中，在pH值为6、加药60min后测定不同温度（4、25、37℃）对Caco-2细胞摄取杜仲提取物的影响。结果（图4-7）显示，在不同温度下，杜仲提取物中的京尼平苷酸等4个成分的细胞摄取量都随着温度的增加而增加。

（九）不同P-gp抑制剂对Caco-2细胞摄取的影响

按上述所确定的pH值6、37℃作为摄取条件，分别加入含同浓度的杜仲提取物（5mg/mL）溶液、含维拉帕米（25μg/mL）的杜仲提取物溶液、含环孢菌素A（10μg/mL）的杜仲提取物溶液，分别与给药60min后测定有无抑制剂存在时Caco-2细胞对杜仲提取物摄取的变化，数据用 ± s 表示，采用SPSS 18.0软件，统计采用单因素方差分析，结果见表4-3。

（十）讨论

小肠是药物口服后主要的吸收部位。目前应用较多的肠吸收实验方法有外翻环法、在体灌流法、外翻肠囊法、Caco-2细胞模型法等，其中Caco-2细胞模型法是研究药物肠吸收的较理想方法。其接近药物在人体内的实际吸收环境，兼具快速、干扰小、易于控制等优点，因而成为近年来国际公认的用于高通量药物肠吸收研究的工具模型。

二、杜仲提取物在体循环灌流肠吸收动力学的研究

在口服药动学的基础上采取大鼠肠循环灌流模型，讨论杜仲提取物中可被吸收成分在大鼠小肠的吸收程度，考察杜仲提取物中原儿茶酸、京尼平苷酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷7种成分在小肠中的吸收特性，以及不同药物浓度、胆汁、肠段、P-gp抑制剂等条件对上述7种成分相关因素的影响等信息。

（一）Krebs-Ringer's（K-R）营养液的配制

称取氯化钙0.37g，葡萄糖1.4g，分别加少量蒸馏水使之溶解。再称取氯化钠7.8g，氯化钾0.35g，碳酸氢钠1.37g，磷酸二氢钠0.32g，氯化镁0.02g，加蒸馏水溶解后与溶解的氯化钙及葡萄糖液混匀，用蒸馏水定容至1L。

（二）杜仲提取物供试液的制备

取适量杜仲提取物，加入适量的K-R营养液，超声使其溶解，10000rpm离心5min，取上清液备用，获得2.0、4.0、8.0mg/mL的供试液。

（三）样品处理方法

取样品液100µL，置于塑料离心管中，加入0.1%的甲酸水溶液100µL，再加入20µg/mL的内标溶液20µL，加入400µL甲醇，涡混1min，15000rpm离心5min，取上清液进样UPLC-MS/MS分析。

（四）大鼠在体循环肠灌流实验

大鼠实验前禁食过夜，可以自由饮水。实验时给大鼠腹腔注射25%乌拉坦1.4g/kg，麻醉后固定。沿腹中线打开腹腔（约4cm），于实验肠段两端各切一小口，在上端小口处插入直径为0.3cm的硅胶软管，并用手术线扎紧。用注射器将37℃的生理盐水缓慢注入肠管，清洗肠内容物至干净。然后在实验肠管下端小口处插入硅胶软管，并用手术线扎紧。肠管两端的硅胶软管与蠕动泵的胶管连接，形成回路，开启蠕动泵。取50mL肠循环液以5mL/min流速循环10min后，将流速调节为2.5mL/min，立刻读出肠循环液的体积并自循环液量筒中取样1mL，作为零时间测定药物浓度的样品，此时需向量筒中补加K-R缓冲溶液1mL。其后每隔30min按照同法读数、取样、补加K-R缓冲溶液，循环3h后终止。根据量筒读数的变化来计算大鼠吸水量，进而计算各时间点药物的量，即剩余药量 在循环回路中用50mL量筒盛装含药肠循环液，每至取样时间点读取液体体积，待循环完毕后，用空气排净管路和肠道内液体，即为管路、肠道的死体积。死体积加上每一时间点的量筒读数体积即为该时间点的循环液体积。以此方法进行肠循环液的体积校正，以剩余药量的自然对数和取样时间 t 作图，求出吸收转化速率常数 K a （h -1 ）、3h百分吸收转化率 A （%）等参数。

（五）数据分析

1.杜仲提取物在体肠吸收中量筒法标定循环液体积、肠剩余药量，分别用公式（4-1、4-2）计算。

2.吸收动力学参数的计算 以小肠内剩余药量的对数（ln X ）对取样时间 t 作图，所得的直线斜率即为吸收速率常数 K a （h -1 ）。

（六）杜仲提取物溶液的pH值对吸收的影响

由于药物吸收可能受到循环液pH值的影响，故考察了杜仲提取物浓度为4.0mg/mL条件下不同pH值（5.0、6.0、6.86、7.4）对杜仲提取物中京尼平苷酸等7种成分的吸收影响，结果见表4-4。

通过方差分析得出，所有成分各pH值条件下的 K a 没有显著性差异（ P ＞0.05），表明几种成分的吸收速率基本不受pH值的影响。通过比较3h累积吸收常数（ A ），结果显示新绿原酸在pH值6.86的吸收要明显高于pH值7.4时，隐绿原酸在pH值6.0或5.0时的吸收要明显高于pH值7.4时，松脂醇二葡萄糖苷在pH值5.0时的吸收要明显高于pH值7.4时，松脂醇单葡萄糖苷在pH值6.86的吸收要明显低于pH值7.4时，统计学有显著性差异。京尼平苷酸、原儿茶酸、绿原酸3种成分经方差分析在各pH值下各成分没有显著性差异，说明这3种成分对pH值不敏感。当pH值为6.0时，各成分的3h累积吸收量相对较高，因此用pH值6.0的杜仲提取物溶液进行浓度、肠段等条件的实验。

（七）杜仲提取物的浓度对吸收的影响

取禁食后的大鼠，随机分组，每组4只。分别考察了质量浓度为2.0、4.0、8.0mg/L（pH值为6.0）的杜仲提取物中京尼平苷酸等7种成分的 K a 和3h累积吸收率，结果见表4-5。

通过比较3h累积吸收常数（ A ），结果显示绿原酸在低浓度时 A （%）要明显低于高浓度时，统计学有显著性差异；新绿原酸、绿原酸、松脂醇单葡萄糖苷在中浓度时 A （%）要明显高于高浓度时，且新绿原酸、绿原酸在中浓度时的 K a 也明显高于高浓度时，统计学有显著性差异。表明新绿原酸、绿原酸、松脂醇单葡萄糖苷在高浓度下可能存在饱和现象，提示其在体内的吸收机制不仅是单纯的被动吸收过程，可能存在主动转运和易化扩散；同时京尼平苷酸、原儿茶酸、隐绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷在不同浓度时的 A （%）没有显著性差异（ P ＞0.05）。

（八）胆汁对杜仲提取物吸收的影响

取4只大鼠，结扎胆管，选择pH值为6.0的中浓度（4.0mg/L）杜仲提取物溶液50mL作为肠灌流液，进行整肠段循环实验，考察胆汁对杜仲提取物肠道吸收的影响。通过比较3h累积吸收常数，经方差分析结果显示胆汁对京尼平苷酸、新绿原酸、原儿茶酸、绿原酸、隐绿原酸、松脂醇单葡萄糖苷在小肠内的吸收均有抑制作用。（表4-6）

（九）P-gp抑制剂对杜仲提取物吸收的影响

取禁食后的大鼠，按照每组4只的数量随机分组。选择pH值为6.0的杜仲提取物中浓度（4.0mg/L）溶液50mL作为肠灌流液，考察维拉帕米对京尼平苷酸等7种成分的吸收情况，探讨其吸收是否受到P-gp外排泵作用的影响。

通过比较3h累积吸收常数，经方差分析结果显示加入P-gp抑制剂后京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸的吸收降低，具有显著性差异；隐绿原酸、松脂醇单葡萄糖苷的吸收有降低趋势、松脂醇二葡萄糖苷的吸收有上升趋势，但不具有显著性差异；原儿茶酸的吸收显著性增加（ P ＜0.05）。说明杜仲提取中原儿茶酸可能是药物转运蛋白P-gp的底物。（表4-6）

（十）杜仲提取物在不同肠段的吸收特点

取禁食后的大鼠，按照每组4只的数量随机分组。对大鼠各肠段分别进行结扎，十二指肠段（自幽门1cm处开始向下10cm处）、空肠段（自幽门15cm处开始向下10cm处）、回肠段（距盲肠上行20cm处开始向下10cm处）、结肠段（从盲肠后端开始向下取10cm处）。选择pH值为6.0的杜仲提取物中浓度（4.0mg/L）溶液50mL作为肠灌流液，分别用供试液对不同肠段进行回流，以考察大鼠肠道各段的吸收情况，结果见表4-7。

比较不同肠段各成分的3h累积吸收常数，其中京尼平苷酸在十二指肠、空肠的吸收较结肠快；新绿原酸在十二指肠的吸收较回肠快；原儿茶酸在空肠的吸收较回肠快；绿原酸在十二指肠、空肠、回肠的吸收较结肠快；隐绿原酸在十二指肠、空肠、回肠的吸收较结肠快，同时在十二指肠的吸收较回肠快；松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷在各肠段的吸收没有显著性差异。

（十一）讨论

实验结果非常不稳定，容易出现负值。分析原因可能为：①杜仲提取物中的可被吸收成分在肠道的吸收量相对较小，导致误差出现。②单向灌流法为15min取样一次，而肠循环灌流法为30min取样一次，累计循环3h，通过更多的循环药液使吸收量累积增加，可能更适用于在肠道的吸收量较小的化合物，从而获得更为稳定的数据，因此选择肠循环灌流法进行实验。

探讨药物在肠道的吸收情况，有利于剂型的选择和辅料的筛选，从而能提高药物的生物利用度，指导临床合理用药。杜仲提取物的7种主要成分在全部肠段均有吸收，而主要的吸收部位在小肠，因此可以进一步讨论将含有以上成分的中药根据其治疗疾病的高发时间制成缓释型或迟释型，以保证在特定时间、特定部位药物吸收的最大化。 Vb3Y/0+ynmEy/jTCoGiNWKC4SA0qcJT2NJjco5ZAcIEOk3wk1F9WgQwDUNI5rJYW