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本研究采用血清药物化学研究方法，通过 UHPLC-Q-TOF-MS 指纹图谱技术观察杜仲经口服后的体内动态过程，以确定杜仲在血中的移行成分，为最终确定杜仲药效物质成分奠定基础。
杜仲加10倍量水煎2h，共煎3次，浓缩，加乙醇醇沉，静置12h，抽滤，回收乙醇，用水饱和的正丁醇（1/2倍量）提取4次，回收正丁醇，上D101大孔树脂，40%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩并真空干燥，得杜仲提取物。
取清洁级SD大鼠，雌雄各半，随机分为2组，即空白组和给药组，禁食12h，自由饮水。按每次96g/kg剂量分2次给予杜仲提取物，并连续给药3d，空白组给予等体积的蒸馏水。于末次给药1h后股动脉采血，取全血置于37℃水浴保温至上层有淡黄色液体析出，取出后15000rpm离心10min，取上层血清。将同一组大鼠的血清混合，以消除个体差异，置于-20℃冰箱保存，备用。
取含药血清和空白血清各1mL，依次加入0.2mL 1%甲酸水溶液、4mL甲醇，涡混2min，超声10min，15000rpm低温离心10min。随后取上清液置氮吹仪中在37℃下吹干。再加入1mL甲醇于吹干样品中，按上述处理方法2次沉淀蛋白，上清液于37℃氮气吹干后，残留物加入200μL甲醇复溶，涡旋2min，超声10min，于冷冻高速离心机15000rpm低温离心10min，得含药血清样品、空白血清样品，备用。
Agilent Eclipse Plus C l8 RRHD色谱柱（100mm×2.1mm，1.8μm）；流动相为0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）。梯度洗脱：0～10min，5%～25%（A）；10～14min，25%～45%（A）；14～17min，45%～100%（A）；17～18min，100%～5%（A）。体积流量0.3mL/min，柱温40℃，进样体积2μL。
电喷雾离子源，扫描方式为正、负离子扫描（ESI - 、ESI + ， m/z 100～1000）；毛细管电压4.5kV；锥孔电压150V；离子源温度110℃；雾化气（N 2 ）压力0.12MPa，温度200℃，体积流量8.0mL/min。准确质量测定采用甲酸钠校正标准液；校正模式选用Enhanced Quadratic。数据分析采用Data Analysis软件、Metabolite Detect 软件。
分别取杜仲提取物样品液和混合对照品溶液进UHPLC-Q-TOF-MS系统分析，得到杜仲提取物样品液（图4-1-A）和混合对照品溶液（图4-1-B）的质谱总离子流色谱图。通过比较杜仲提取物样品液和混合对照品溶液的保留时间（ t R ），以及分析二级碎片离子信息，在杜仲提取物样品液中归属了10个色谱峰，确定1号为京尼平苷酸、2号为原儿茶酸、3号为新绿原酸、4号为绿原酸、5号为隐绿原酸、6号为京尼平苷、7号为松脂醇二葡萄糖苷、9号为松脂醇单葡萄糖苷；并通过参阅文献和分析质谱二级碎片离子信息，推断8号可能为1-羟基松脂醇单葡萄糖苷、10号可能为杜仲醇（表4-1）。
图4-1 杜仲提取物样品液和混合对照品溶液的总离子流色谱图
A.杜仲提取物样品液；B.混合对照品溶液。
表4-1 杜仲提取物总离子流色谱峰保留时间及归属
运用 Metabolite Detect 软件将空白血清色谱图（图4-2-C）从给药血清色谱图（图4-2-B）中扣除，得到差异图谱（图4-2-D）。通过比较杜仲提取物样品液、杜仲提取物含药血清和空白血清差异色谱图发现，除去血清中的固有成分，杜仲含药血清中出现了7种移行成分。采用对照品对照，确定其中5个色谱峰所表征的化学成分为原型吸收入血成分，依次为京尼平苷酸（1）、原儿茶酸（2）、京尼平苷（6）、松脂醇二葡萄糖苷（7）、松脂醇单葡萄糖苷（9）；并通过查阅文献，结合化合物相对分子质量和质谱碎片离子信息，推断出2个色谱峰所表征的化学成分可能为1-羟基松脂醇二葡萄糖苷（8）、杜仲醇（10）。
图4-2 杜仲含药血清总离子流色谱图
A.杜仲提取物；B.末次给杜仲提取物60min后含药血清；C.空白血清；D.含药血清与空白血清差异图。
UHPLC-Q-TOF-MS 具有液相色谱强大的分离能力和质谱的高分辨能力等特点，目前已成为体内药物分析的首选方法。本实验采用 UHPLC-Q-TOF-MS 系统建立了生物样品中可靠的定性分析方法。该方法能够较全面地反映杜仲口服后吸收入血的药物成分，为快速确定杜仲药效物质基础及代谢研究奠定基础。为了获得分离度好、灵敏性高，以及信息量丰富的色谱图，本实验对色谱条件进行了优化，包括流动相的组成、进样体积、运行时间的选择。并且实验中分别采用正、负离子扫描方式对混合对照品溶液及杜仲提取物样品液进行全扫描，结果发现在负离子模式下杜仲提取物样品液中的化合物响应相对较高，各色谱峰之间实现了较好的分离，因此实验选择了负离子模式为测试模式。
根据文献报道和前期预实验结果得出了给药剂量为每次96g/kg，并分2次给药。含药血清包括许多内源性杂质和蛋白类成分，直接进样检测可能会干扰实验结果，并且会对仪器造成污染，因此本实验对血清样品的处理方法亦进行了考察，如分别考察了有机溶剂沉淀蛋白法、醋酸乙酯萃取法、热水浴法、HLB固相小柱萃取4种方法对血清样品的影响，最终选择信息量最大的甲醇沉淀法对样品进行处理。但由于甲醇沉淀法不能有效去除所有的内源性物质，因此运用Metabolite Detect 软件将空白血清色谱图从含药血清色谱图中扣除，得到差异图谱，进一步提高了定性分析的准确性及工作效率。在考察确定了给药方案后，开始制备含药血清，但只找到少量吸收入血的木脂素类和环烯醚萜类原型成分，未找到绿原酸及其同分异构体，可能是因为这些成分在大鼠体内发生了生物转化，因此有待进一步研究各个成分在大鼠体内的代谢过程。