第三节
组织分布研究

通过对隔山消吸收特性的研究已经了解了丁香酸、东莨菪内酯、白首乌二苯酮、告达亭、青阳参苷元和去酰基萝藦苷元的吸收特性，其中丁香酸、告达亭在血中含量较低或可能不入血。因此，本部分实验将通过建立的UPLC-MS/MS分析方法测定隔山消提取物灌胃给药后东莨菪内酯、白首乌二苯酮、青阳参苷元和去酰基萝藦苷元4种成分在大鼠体内心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠和胃组织中的药物含量，考察4种成分的分布特点，为隔山消的归经研究奠定基础。

一、色谱条件

Acquity UPLC BEH C 18 色谱柱（2.1mm×50mm，1.7μm）；Waters Van Guard BEH C 18 保护柱（2.1mm×5mm，1.7μm）；流动相为0.2%甲酸水溶液（A）-0.2%甲酸乙腈（B）；柱温40℃；进样体积为1μL。梯度洗脱条件见表3-8。

二、质谱条件

电喷雾离子源（ESI），毛细管电压1kV，离子源温度120℃，去溶剂气（氮气）流速1000L/h，去溶剂气温度400℃，碰撞气（氩气）150L/h；扫描方式为多反应离子监测（MRM）模式，各成分监测离子见表3-9。

三、组织样品的收集

随机选取SD大鼠，实验前不禁水，禁食12h。按照0.1g/100g（相当于生药量16.13g/100g）的剂量灌胃隔山消提取物，每个时间点6只大鼠，于给药前及给药后0.17h、0.5h、1h、2h、4h处死大鼠并解剖取出各组大鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠和胃组织，用生理盐水洗净组织表面血液，以及小肠、胃内的内容物，用滤纸吸干液体，所有组织均放在-80℃冰箱保存，备用。临用前解冻并称取各组织样品，加生理盐水（胃和小肠 v ∶ w = 4∶1；其他组织 v ∶ w = 2∶1），剪刀剪碎并用组织匀浆机研磨得到各组织匀浆液。

四、样品处理方法

取上述各组织匀浆液300μL（胃及小肠组织稀释3倍后取300μL）置于2mL离心管中，分别加入20μL葛根素（201.10ng/mL）、30μL 1%的甲酸水，涡混3min，再加入1.2mL乙腈沉淀蛋白，涡混5min，超声10min，-20℃冰箱中冷冻30min后，14000rpm离心10min，转移上清液用氮吹仪在37℃下吹干。干燥残留物加入200µL 50%甲醇水，超声复溶，14000rpm离心10min，上清液于UPLC-MS/MS进样分析。

五、组织分布数据处理

运用Phoenix WinNonLin 8.2数据处理软件中的非房室模型（NCA）分析方法拟合青阳参苷元等4种成分在组织中的 AUC 0→t 参数。实验结果用 ±SD表示，用独立样本t检验进行组间比较， P ＜0.05为有统计学意义。

六、各成分在大鼠体内的组织分布情况

对大鼠口服隔山消提取物后在各时间点心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脑组织中的分布情况应用已建立的UPLC-ESI-MS/MS分析方法测定，见图3-4～3-7和表3-10～3-13，结果以每1g组织中含有被测成分的量（ng）表示，采用Phoenix WinNonLin 8.2软件计算各成分在各组织中的 AUC 0→t 参数，见图3-8。

（一）东莨菪内酯在大鼠体内的组织分布情况

大鼠在口服隔山消提取物后东莨菪内酯在各组织中的分布情况见图3-4、表3-10和图3-8。结果显示，灌胃隔山消提取物后，10～30min时东莨菪内酯在各组织中含量即达到峰值，提示东莨菪内酯在给药后能迅速分布到各组织中；在给药4h后，各组织中药物基本清除完毕；东莨菪内酯在胃组织中的含量最高，其次是小肠组织，心组织中含量最低，提示其和胃组织的亲和力较高，胃组织可能是其主要的靶器官。东莨菪内酯的结构包含内酯及甲氧基，脂溶性较高，应易透过血脑屏障，但脑组织中未检出，可能是因为东莨菪内酯本身含量较低，且具有广泛的代谢途径，而口服给药生物利用度低，因而在脑组织中未检测到。

（二）白首乌二苯酮在大鼠体内的组织分布情况

大鼠在口服隔山消提取物后白首乌二苯酮在各组织中的分布情况见图3-5、表3-11和图3-8。结果显示，灌胃隔山消提取物后，0.17～1h时白首乌二苯酮在各组织中含量即达到峰值，提示白首乌二苯酮在给药后能迅速分布到各组织中；给药4h后，白首乌二苯酮在各组织中基本清除完毕；白首乌二苯酮在肺组织中的含量最高，在心组织中含量最低，提示其和肺组织的亲和力较高。

（三）青阳参苷元在大鼠体内的组织分布情况

大鼠在口服隔山消提取物后青阳参苷元在各组织中的分布情况见图3-6、表3-12和图3-8。结果显示，灌胃隔山消提取物后，在10～30min时青阳参苷元在各组织中含量即达到峰值，提示给药后青阳参苷元能迅速分布到各组织中；给药4h后，青阳参苷元在各组织中基本清除完毕；青阳参苷元在小肠、胃、肝组织中的含量最高，在脑组织中含量最低，提示其和小肠、胃及肝组织的亲和力较高，小肠、胃组织可能是其主要的靶器官。

（四）去酰基萝藦苷元在大鼠体内的组织分布情况

大鼠在口服隔山消提取物后去酰基萝藦苷元在各组织中的分布情况见图3-7、表3-13和图3-8。结果显示，灌胃隔山消提取物后，10～30min时去酰基萝藦苷元在各组织中含量即达到峰值，提示去酰基萝藦苷元在给药后能迅速分布到各组织中；给药4h后，去酰基萝藦苷元在各组织中基本清除完毕。去酰基萝藦苷元在胃及小肠组织中的含量最高，提示其和胃、小肠组织的亲和力较高，胃及小肠组织可能是其主要的靶器官；其次是肝和肾组织，提示其可能主要通过尿液的方式排出体外；脑组织中含量最低。

七、讨论

药物吸收入血后，需随血液循环系统分布到相应的靶细胞、靶器官、靶组织以发挥药效，可见药物分布是药效产生的一个关键过程，考察药物有效成分在体内的组织分布至关重要。组织分布的规律有助于揭示药物在体内的分布规律和药物作用的靶向性，是指导临床应用的重要环节，也是阐明中药归经的必要途径。此外，组织分布对药物的毒理学研究、评价药物的长期毒性、新药的安全性评价等均具有重要的意义。

大鼠的组织分布情况结果显示，东莨菪内酯在各组织中4h的 AUC 0→t 从高到低依次为：胃＞小肠＞肾＞肝＞肺≈脾＞心。白花蛇舌草中东莨菪内酯的组织分布结果与本研究相似。白首乌二苯酮在各组织中4h的 AUC 0→t 从高到低依次为：肺＞脾＞肾＞肝＞胃≈脑＞小肠＞心。青阳参苷元在各组织中4h的 AUC 0→t 从高到低依次为：小肠＞肝＞胃＞肾＞心＞肺＞脾＞脑。去酰基萝藦苷元在各组织中4h的 AUC 0→t 从高到低依次为：胃＞小肠＞肝＞肾＞心≈脾＞肺＞脑。可见，除白首乌二苯酮外，其余3种成分主要分布于胃、小肠组织，提示胃肠组织是隔山消的主要靶器官。

FD的重要发病因素之一是胃肠运动障碍。胃肠内分泌细胞分泌的激素紊乱和中枢肠神经系统释放的神经递质调节异常，均可严重影响胃肠道的运动功能。GAS和MTL均属于胃肠激素，GAS主要由G细胞分泌，大多存在于胃窦、胃底及十二指肠近端黏膜，受迷走神经兴奋性调节，能促进盐酸、胃蛋白酶原分泌，保护胃肠黏膜，增强胃肠道的运动能力；MTL由Mo细胞分泌，可直接作用于胃平滑肌的特异性受体，释放乙酰胆碱，促进胃强力收缩和小肠分节运动，促进胃排空。有研究发现FD患者的这两项胃肠动力激素均较低。青阳参苷元等成分在大鼠的胃及小肠组织中的含量较高，提示胃肠组织可能是隔山消抗FD的主要靶器官，其通过降低胃肠激素GAS和MTL含量发挥抗FD作用。 LPiufMbefBxXviZ7F80lumh9aGNfo/6nJNrWNfP2lEvAMeJH4154mmmyC4b4ASUG

第四节
排泄研究

排泄作为药物体内消除过程的最后一个环节，是指药物经机体吸收、分布及代谢等一系列过程后以原型或代谢物的形式随尿液、粪便等排出体外的过程。排泄作为药物代谢动力学的一个重要过程，与药物的药效、药效维持时间和药物毒副作用都有着密切的联系，当药物的排泄率较高时，生物体内药物浓度迅速降低，可能导致药效降低；而当药物的排泄率过低时，生物体内药物浓度较高，则可能产生毒副作用。因此，研究药物的排泄更有助于了解药物在体内的代谢特点，而且可以根据不同排泄途径的差异，结合主要代谢器官的功能情况调整药物的临床用量。本研究主要考察隔山消中4种主要活性成分（青阳参苷元、去酰基萝藦苷元、白首乌二苯酮和东莨菪内酯）在大鼠体内的排泄动力学过程及其差异，旨在更好地为隔山消的深入开发及临床应用提供参考。

一、色谱条件

同“第三节”“一、色谱条件”项。

二、质谱条件

同“第三节”“二、质谱条件”项。

三、排泄样品的收集

（一）尿液和粪便样品收集

取代谢笼，放入SD大鼠，自由饮水，于给药前禁食12h，对空白尿液及粪便进行收集。按0.1g/100g的剂量灌胃隔山消提取物，给药后收集各时间段（0～4h、4～8h、8～12h、12～24h、24～36h、36～48h、48～60h、60～72h、72～84h）尿液及粪便样品，然后对收集的尿液体积进行计量，并称量50℃烘干后粪便的重量，记录。保存到-80℃冰箱中，备用。

（二）胆汁样品收集

取禁食（12h）但不禁水的大鼠，共6只，以剂量为1.0～1.2g/kg乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，于手术板上仰卧固定，开腹，小心分离出胆管，在胆管上切口，之后插入内径为1.5mm的硅胶管，固定胆管插管并用手术线缝合。按0.1g/100g的剂量灌胃隔山消提取物，给药后分段（各时间段分别为0～2h、2～4h、4～6h、6～8h、8～12h、12～24h、24～36h）收集并记录胆汁样品体积，置于-80℃冰箱中储存，备用。

四、样品处理方法

（一）尿液样品处理方法

取200µL大鼠尿液，分别加入20µL 1%甲酸水、20μL浓度为201.10ng/mL 的葛根素内标，涡混后加入800µL乙腈，涡混5min，超声10min（40Hz），15000rpm离心10min，转移上清液。残渣再用800µL乙腈涡混5min，超声10min（40Hz），15000rpm离心10min。合并两次上清液并于37℃下在氮吹仪中吹干，吹干样品用200µL 50%甲醇水超声复溶，15000rpm离心10min，转移上清液进UPLC-MS/MS分析。

（二）粪便样品处理方法

称取0.25g烘干研磨后的大鼠粪便样品，加入4倍量生理盐水，制成25%的粪便匀浆液，涡混3min，超声10min，12000rpm离心10min后分离上清液。取上述粪便上清液200µL，分别加入20µL 1%甲酸水、20μL浓度为201.10ng/mL 的葛根素溶液，涡混后加入800µL乙酸乙酯萃取，涡混5min，超声10min（40Hz），15000rpm离心10min，转移上清液，下层液体再用800µL乙酸乙酯涡混5min，超声10min，15000rpm离心10min。合并两次上清液，用氮吹仪在37℃下吹干，吹干样品用200µL 50%甲醇水超声复溶，15000rpm离心10min，转移上清液进UPLC-MS/MS分析。

（三）胆汁样品处理方法

取200µL大鼠胆汁样品，置于1.5mL离心管中，其余同“粪便处理方法”。

五、数据处理

运用Excel软件处理数据，大鼠尿液、粪便、胆汁中青阳参苷元、去酰基萝藦苷元、白首乌二苯酮和东莨菪内酯的累积排泄率=累积排泄量/（给药量×提取物中对应成分的含量）×100%。数据结果用 ± s 表示，用独立样本t检验进行组间比较， P ＜0.05计为有统计学意义。

六、隔山消提取物的尿液排泄结果

给大鼠灌胃隔山消提取物后，青阳参苷元等4种成分均可在大鼠尿液中检测到。结果显示，东莨菪内酯等4种成分在给药后84h内经尿液的排泄量均较低，其中青阳参苷元的累积尿液排泄量在4种成分中最小，不足给药量的0.1%；去酰基萝藦苷元在尿液中的累积排泄量在4种成分中最高，约占给药量的6.7%；白首乌二苯酮不足给药量的1.0%；东莨菪内酯不足给药量的1.0%。（图3-9，表3-14）

七、隔山消提取物的粪便排泄结果

东莨菪内酯等4种成分均可在大鼠粪便中检测到。结果显示，东莨菪内酯等4种成分在给药后84h内经粪便排泄的量均较低，其中东莨菪内酯、青阳参苷元不足给药量的1.0%；去酰基萝藦苷元不足给药量的2.0%；白首乌二苯酮不足给药量的0.6%。（图3-10，表3-14）

八、隔山消提取物的胆汁排泄结果

在胆汁中青阳参苷元等4种成分在给药后36h内的排泄量均较低，其中青阳参苷元、去酰基萝摩苷元、东莨菪内酯均不足给药量的0.3%；白首乌二苯酮不足给药量的0.005%。（图3-11，表3-14）

综上，除粪便中的白首乌二苯酮外，84h内青阳参苷元等成分在尿液、粪便和胆汁中均未达到坪值；同时计算大鼠口服隔山消提取物后84h内各成分在尿液、粪便和给药后36h胆汁中的累积排泄量及累积排泄率，结果见表3-14。

九、讨论

中药化学成分复杂且含量一般较低，进入体内的量较少，超高液相色谱-质谱联用技术因其强大的分离分析能力、快捷的分析速度、较高的灵敏度而成为目前中药药物代谢动力学研究中首选的分析方法。样品前处理方法是中药生物样品化学分析必不可少的环节，而优良的样品前处理方法可保护色谱柱，使测定成分的可行性更高、分析结果更准确、精密度更好。液-液萃取法和蛋白沉淀法是高效液相色谱-质谱联用法中常用的样品处理方法，而且比较简便、快捷。在选择样品处理方法时，首先对尿液、粪便（生理盐水溶解后取上清液）和胆汁用乙腈、甲醇蛋白沉淀法和乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取法，以及处理次数、流动相梯度进行考察，综合考虑各成分的提取回收率和基质效应，最终选择尿液用乙腈、粪便和胆汁用乙酸乙酯进行2次样品处理。同时，发现尿液基质对去酰基萝藦苷元和东莨菪内酯的MS强度有一定抑制作用（基质效应55.49%～64.54%， RSD 不大于8%）。根据2007年“定量生物分析方法研讨会”报道的基质效应变异系数不得大于15%，说明本方法稳定。

通过比较尿液、粪便和胆汁的排泄结果发现，灌胃给予隔山消提取物后，青阳参苷元经粪便的累积排泄率最高（达到0.32%），尿液中最低（不足给药量的0.1%），提示青阳参苷元在体内有较为广泛的代谢途径，未经代谢的青阳参苷元主要经粪便排泄。去酰基萝藦苷元在大鼠尿液、粪便及胆汁中的累积排泄率均大于其他成分，其原因可能为：①去酰基萝藦苷元在隔山消提取物中的含量最高（隔山消提取物中各成分的含量由高到低依次为：去酰基萝藦苷元＞青阳参苷元＞白首乌二苯酮＞东莨菪内酯）。②去酰基萝藦苷元和青阳参苷元都为C 21 甾体化合物。青阳参苷元的C-12位酯键可能会断裂形成去酰基萝藦苷元代谢产物。去酰基萝藦苷元经尿液的累积排泄率最高（达到6.70%），胆汁中最低（不足给药量的0.2%），提示去酰基萝藦苷元经口服给药后主要经尿液排泄，这与其在肾组织中含量较高相对应。白首乌二苯酮的累积排泄率在尿液（0.20%）、粪便（0.41%）中最高，胆汁（不足给药量的0.005%）中最低，提示白首乌二苯酮在体内经广泛代谢后，未经代谢的部分主要经粪便排泄。东莨菪内酯在尿液、粪便和胆汁中的累积排泄率不足3%。有研究显示，东莨菪内酯在大鼠体内胃肠道的吸收能力和代谢功能很强；静脉注射东莨菪内酯可发生还原、异构、葡萄糖醛酸化和磺酸化反应生成代谢产物；大鼠肝微粒体孵育体系中可发生脱甲基化和葡萄糖醛酸化反应。提示东莨菪内酯经口服给药后大部分以代谢物形式排泄，少部分原型成分主要随尿液（占给药量0.83%）排泄，较少部分直接经粪便（占给药量的0.72%）排泄。 vGa09IVcTjL3ytn2L8pBT8TxOzK1+CApsd/HSryp4mqGsEKq7HHIwWSQmAnEcPwR

第五节
药代动力学研究

在前期研究的基础上，本实验选择白首乌二苯酮、去酰基萝藦苷元、青阳参苷元3种主要成分作为PK makers（东莨菪内酯无法绘制完整药时曲线），开展其在大鼠体内的药代动力学研究，并通过分析获得其药动学参数，以揭示3种成分在大鼠体内的经时变化规律。同时，通过比较白首乌二苯酮等3种成分的药动学差异，为隔山消的深入开发和利用提供参考依据。

一、色谱条件

Acquity UPLC BEH C 18 色谱柱（2.1mm×50mm，1.7μm）；Waters Van Guard BEH C 18 保护柱（2.1mm×5mm，1.7μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）- 0.1%甲酸乙腈（B），流速0.35mL/min；柱温40℃；进样量2μL。液相梯度洗脱条件见表3-15。

二、质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI）；毛细管电压1kV；离子源温度120℃；去溶剂气（氮气）流速1000L/h，去溶剂气温度400℃；碰撞气（氩气）150L/h；扫描方式为多反应离子监测模式（MRM）。白首乌二苯酮等3种成分及内标的监测离子见表3-16。

三、给药方式

取6只SPF级雄性SD大鼠，体质量为230～250g。单次灌胃给予隔山消提取物溶液10mL/kg，于给药后0.033、0.083、0.16、0.25、0.33、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24、48h经尾静脉取血约0.3mL，置于涂有肝素的离心管中，4500rpm离心15min，分离血浆，置于-20℃冰箱保存，备用。

四、血浆样品前处理

取大鼠血浆100µL置于1.5mL离心管中，加入1%甲酸水10µL，涡混，加入201.1ng/mL葛根素10µL，加入400µL乙腈沉淀蛋白，涡混5min，超声10min，14000rpm离心10min，转移上清液用氮吹仪在37℃下吹干。吹干样品加入150µL初始流动相溶解，超声10min，14000rpm离心10min，取上清液UPLC-MS/MS进样分析。

五、药代动力学数据处理

采用Phoenix WinNonLin 8.2数据处理软件中的非房室模型（NCA）分析方法拟合各药动学参数。采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，实验结果用 ±SD表示，用独立样本t检验进行组间比较， P ＜0.05为有统计学差异。

六、隔山消提取物在大鼠体内的药动学结果

应用建立的UPLC-MS/MS分析方法测定大鼠口服隔山消提取物后各时间点的血药浓度，得到的数据见表3-17和表3-18，平均血药浓度-时间曲线见图3-12。采用Phoenix WinNonLin 8.2软件计算药动学参数，并对药物在大鼠体内的动力学过程进行非房室模型拟合，其相关药动参数见表3-17和表3-18。

灌胃给予隔山消提取物后，大鼠血浆中白首乌二苯酮在15min左右达到最大血药浓度，去酰基萝藦苷元在30min左右达到最大血药浓度，青阳参苷元在15min左右达到最大血药浓度。

七、讨论

由于血浆样品中内源性杂质多、样品浓度低、样品量受限等因素，因此血浆样品的处理方法在药动学的研究中至关重要。在样品制备方面，实验考察了液-液萃取（乙酸乙酯、正丁醇）和有机溶剂（甲醇、乙腈）蛋白质沉淀等方法对含药血浆进行前处理，然后进样检测，结果显示，经乙腈沉淀法处理的血浆样品能检测到的成分最多，峰形较好且响应高，故采用乙腈沉淀法作为本实验样品的处理方法。此外，由于待测成分为苯乙酮、C 21 甾体和酚酸类化合物，因其主要为极性较大的弱酸性化合物，在酸性条件下处于非解离状态，有利于被测成分的提取，因此本实验对在血浆样品处理中是否加甲酸及加入甲酸的比例进行考察。结果显示，加入甲酸后明显有利于被测成分的提取，且加入1%的甲酸水后各成分响应较好，因而最终确定血浆样品的处理方法为先用1%的甲酸酸化，再加入乙腈进行蛋白沉淀处理，并及时涡混，防止形成的蛋白包裹待测成分。

隔山消提取物中白首乌二苯酮、去酰基萝藦苷元、青阳参苷元3种成分在SD大鼠体内达到最大血药浓度的时间（ t max ）为0.25～0.42h，表明这三种成分在大鼠体内的吸收速率较快。其中白首乌二苯酮的达峰时间（ t max ）为0.26±0.03h，与牛景梅等的报道基本一致， CL ［0.36±0.03 L/（h·kg）］最低，表明其在大鼠体内的消除最慢。青阳参苷元的 C max （611.37±53.33µg/L）、 AUC 0→t ［986.02±149.76（µg·h）/L］、 AUC 0→∞ ［1205.2±453.77（µg·h）/L］明显低于白首乌二苯酮和去酰基萝藦苷元，而其 CL ［8.73±2.11 L/（h·kg）］、 MRT 0→t （11.05±3.33h）、 MRT 0→∞ （18.18±9.66h）明显高于白首乌二苯酮和去酰基萝藦苷元，说明相较于其他两种成分，青阳参苷元在大鼠体内的吸收程度最低，消除较快。 vGa09IVcTjL3ytn2L8pBT8TxOzK1+CApsd/HSryp4mqGsEKq7HHIwWSQmAnEcPwR