第二节
吸收研究

胃肠道吸收是口服药物产生全身治疗作用的重要前提。小肠是药物吸收的主要部位，也是药物转运的特异性部位。目前，关于中药成分肠吸收模型的研究主要有离体外翻肠囊法、在体法和体内法。离体外翻肠囊法操作简单、实验周期短，可以用于药物早期高通量筛选，但肠道的不同节段及缺乏血液、淋巴液的供应对细胞旁路通道和酶活性造成的影响均会影响实验结果。离体外翻肠囊法使用的组织活性与其在体内环境中会存在较大差异，不能反映药物在肠道环境中的真实吸收情况。在体循环肠灌流模型神经内分泌调节与淋巴液、血液供应完整，实验条件接近动物体内真实情况，可以避免胃肠道内容物及胃肠运动的影响。药物的肠吸收研究通常需采用2种及2种以上的肠吸收模型来相互佐证，故本研究同时采用了离体外翻肠囊法和在体循环肠灌流法，考察不同影响因素下隔山消提取物中6种主要成分（丁香酸、东莨菪内酯、白首乌二苯酮、告达亭、青阳参苷元和去酰基萝藦苷元）的肠吸收特性。

一、基于离体外翻肠囊模型的吸收特性研究

（一）隔山消提取物的制备

取隔山消干燥药材，用70%乙醇回流提取3次，滤液减压回收乙醇至无醇味，残留物加水至每1mL含1g生药，取上清液过D101大孔树脂柱，依次用水、60%乙醇为洗脱剂，收集60%乙醇洗脱液，减压回收溶剂至稠膏，烘干，打粉。

（二）色谱条件

Waters BEH C 18 色谱柱（2.1mm×50mm，1.7µm），Waters Van Guard BEH C 18 保护柱（2.1mm×5mm，1.7µm），柱温40℃，流速0.35mL/min，流动相为0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），进样体积1μL，梯度洗脱条件见表3-1。

（三）质谱条件

电喷雾电离源（ESI），毛细管电压3kV，离子源温度150℃；去溶剂气温度400℃，去溶剂气N 2 ，流速800L/h；反吹气N 2 ，流速为50L/h；质谱数据采集及处理软件为MassLynx V4.1工作站；扫描方式为单离子监测模式（SIR）。各离子条件如表3-2所示。

（四）溶液的配置

1.标准溶液的配置 精密称取对照品东莨菪内酯、丁香酸、青阳参苷元、去酰基萝藦苷元、告达亭、白首乌二苯酮适量，加甲醇溶解并定容至刻度，制得浓度分别为0.9741、0.9898、1.366、0.9518、0.9761、0.9996mg/mL的储备液，于-20℃冰箱中避光保存备用。临用前用甲醇将储备液稀释至适当浓度即得。

2.内标溶液的配置 取葛根素对照品适量，加甲醇定容至10mL，得1.006mg/mL的内标溶液，-20℃保存，备用。

3.Tyrode缓冲液的制备 称取NaCl 8.0g、KCl 0.2g、NaHCO 3 1.0g、NaH 2 PO 4 0.05g、MgCl 2 0.1g、葡萄糖1.0g，加少量蒸馏水溶解后与单独溶解的CaCl 2 0.2g混匀，最后加入葡萄糖1.0g溶解，溶解后加蒸馏水定容至1L。

4.隔山消提取物供试液的制备 取隔山消提取物适量，加入适量的Tyrode缓冲液超声30min溶解，5000rpm离心10min，取上清液，得7.5、15、30mg/mL的供试液。

（五）大鼠离体外翻肠囊实验

取雄性SD大鼠5只，实验前禁食12h，断颈椎处死，迅速沿腹中线剪开腹腔，分别取出目标肠段（十二指肠段为自幽门1cm处往下取10cm，空肠段为自幽门15cm处往下取10cm，回肠段为自盲肠上端20cm处往下取10cm，结肠段为自盲肠下端开始往下取10cm）。将剪下的肠管放入0℃的Tyrode缓冲液中冲洗，至无肠内容物为止。将自制硅胶套管软端插入肠管用丝线结扎小心将肠道翻转，用37℃的台氏液冲洗内表面，将另一端用丝线结扎成囊状。将肠管放入盛有10mL 37℃恒温台氏液的麦氏浴管中，通入混合气体（95% O 2 和5% CO 2 ）。在肠管中注入空白Tyrode缓冲液1.5mL，平衡5min，然后将空白Tyrode缓冲液换成质量浓度分别为7.5、15.0、30.0mg/mL的供试液，分别在15、30、45、60、90、120min从肠囊内取样300µL，同时补加300µL 37℃的空白Tyrode缓冲液。样品放入干净EP管中，置于-20℃保存备用。实验结束后取出各肠段，并将肠管纵向剖开，自然摊于滤纸上测量长度（ L ）和内径（ r ），记录吸收面积（ A ）。

（六）样品处理方法

取样品300µL，加入10µL葛根素（10mg/L）内标溶液，加入100µL 1%甲酸水溶液，再加入600µL乙腈，涡混3min，超声10min，14000rpm离心10min。取上清液于37℃下N 2 吹干，残渣加入150µL 50%甲醇水溶液复溶，涡混3min，超声10min，14000rpm离心10min。取上清液UPLC-MS/MS进样分析。

（七）不同浓度隔山消提取物各成分在大鼠肠段不同部位由黏膜侧向浆膜侧转运情况

剪取大鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠各肠段，按照“（五）”“（六）”项下操作，计算丁香酸等6种成分在120min内各肠段累积吸收量（ Q ）（表3-3）和药物吸收速率常数（ K a ）（表3-4），绘制 Q-t 曲线。

结果表明，隔山消提取物中6种成分均可吸收进入肠囊，各成分的累积吸收量-时间曲线均有上升趋势，未呈饱和现象，提示6种成分在120min内吸收未达到饱和状态。通过对丁香酸等6种成分在各肠段的 Q-t 曲线进行回归分析，结果显示，除东莨菪内酯外，其余成分的回归相关系数（ R 2 ）均大于0.9，符合一级吸收速率，提示其吸收方式可能为被动扩散。而东莨菪内酯只在低剂量的所有肠段、中高剂量的回肠和结肠的回归相关系数大于0.9，提示其在体内的吸收机制可能有主动转运过程。

（八）不同浓度隔山消提取物中各成分在大鼠不同肠段的120min Q 及 K a 比较

对不同浓度隔山消提取物中6种成分在大鼠不同肠段的120min Q 和 K a 进行比较，见表3-3、表3-4。结果表明，6种成分的吸收特征较为复杂，随着剂量的增加，除告达亭和去酰基萝藦苷元在中剂量的十二指肠、空肠累积吸收量较低外，其余各成分在各肠段的 Q 和 K a 值随浓度的增加而增加，但低、中剂量比较并不完全具有统计学差异，而高剂量时显著增加（ P ＜0.05）。

各成分在不同浓度下的吸收顺序也发生了变化，如青阳参苷元中浓度的总体吸收趋势为回肠＞空肠＞结肠＞十二指肠，而高浓度时其总体吸收趋势为十二指肠＞回肠＞结肠＞空肠。

（九）讨论

隔山消提取物中6种成分均可在小肠被吸收，其吸收方式可能为主、被动同时存在或存在其他复杂的吸收方式。通过 Q 和 K a 数据可见，同一成分不同浓度在不同部位未表现出一致的吸收趋势，但就其主要吸收部位而言，各成分基本在回肠、结肠、十二指肠吸收较好，说明小肠对中药成分的吸收具有选择性。本实验采用外翻肠囊模型，研究了不同浓度隔山消提取物的大鼠肠吸收特性，并对其吸收机制进行详细探讨。通过体外实验结果可推测入血成分，为进一步研究隔山消提取物可被吸收入血的主要活性成分研究奠定了基础。

二、基于在体肠循环肠灌流模型的吸收特性研究

（一）隔山消提取物肠循环液的制备

取隔山消提取物适量，其中各成分质量分数分别为丁香酸0.0117%、东莨菪内酯0.0114%、白首乌二苯酮0.4923%、告达亭0.3211%、青阳参苷元0.9713%和去酰基萝藦苷元1.3662%，加入适量的K-R液，超声30min溶解，5000rpm离心10min，取上清液，得到含隔山消提取物的浓度分别为7.5、15、30mg/mL的肠循环溶液。

（二）样品处理方法

取收集的肠循环样品100µL，加入葛根素内标溶液10µL、1%甲酸水溶液40µL，再加入200µL乙腈，涡旋3min，超声10min，14000rpm离心10min。取上清液于37℃N 2 吹干，残渣加入300µL 50%甲醇溶液复溶，涡旋3min，超声10min，14000rpm离心10min。取上清液进样分析。

（三）大鼠在体肠循环灌流实验

取健康SD大鼠，实验前自由饮水，禁食12h，腹腔注射20%乌拉坦（1.5g/kg）麻醉，进行在体肠循环灌流手术操作。在灌流前，用生理盐水冲洗肠道直至无内容物，然后使用恒流泵排尽肠道内水分。取恒温至37℃的隔山消提取物溶液50mL，以3.0mL/min的流速循环平衡10min后，调节流速为2.5mL/min，并迅速读出肠循环液的体积且从循环液中取出1mL样品，作为0点样品。之后于不同时间点（10、30、60、90、120min）同法读数取样，每次取样后补加等体积的37℃空白K-R液，循环2h后结束。

（四）数据分析方法

计算剩余药量 t n P （µg）和灌流2h的累积吸收转化率 A （%），公式如下。

其中 t n C 为 t n 时刻肠循环液药物浓度， t n V 为 t n 时刻肠循环液体积， t 0 P 为0h时的剩余药量， t n P 为 t n 时刻循环液中的剩余药量， A 为2h累积吸收转化率。以剩余药量的自然对数对取样时间 t 作图，所得的直线斜率即为吸收速率常数 K a 。结果用 ± s 表示，利用统计学软件SPSS 22.0进行分析，两组比较采用独立样本t检验， P ＜0.05表示差异具有统计学意义。

（五）隔山消提取物的大鼠不同肠段的吸收差异

取SD大鼠20只，分成4组（十二指肠组、空肠组、回肠组、结肠组），每组5只。选取15.0mg/mL的隔山消提取物溶液为肠循环灌流液，对不同肠段进行回流，考察其在大鼠不同肠段的吸收情况。结果表明，丁香酸、告达亭、青阳参苷元和去酰基萝藦苷元的最佳吸收部位均为回肠；东莨菪内酯、白首乌二苯酮的最佳吸收部位分别为空肠和十二指肠。（图3-1，表3-5）

（六）不同剂量隔山消提取物大鼠的吸收差异

取SD大鼠15只，每组5只，选取十二指肠段，分为考察低剂量组（7.5mg/mL）、中剂量组（15.0mg/mL）、高剂量组（30.0mg/mL）对肠吸收的影响。结果表明，与中剂量组相比，高剂量组中白首乌二苯酮和告达亭的累积吸收转化率（ A ）和吸收速率常数（ K a ）均显著降低（ P ＜0.05），存在高剂量饱和现象，提示其吸收机制可能为主动转运；丁香酸、东莨菪内酯和去酰基萝藦苷元表现出来的变化趋势均不呈线性改变；青阳参苷元吸收呈上升趋势，但无显著性差异。表明除白首乌二苯酮和告达亭外，其余4种成分并非一种吸收方式，可能还存在其他跨膜转运方式。（图3-2，表3-6）

（七）胆汁对隔山消提取物在大鼠体内肠吸收的影响

选取15.0mg/mL的隔山消提取物溶液为肠循环灌流液，取大鼠的十二指肠段，除不结扎胆管外，其他步骤按“（二）”“（三）”项下方法操作，与结扎了胆管的大鼠十二指肠肠吸收进行比较。结果表明，胆汁对丁香酸具有明显的促进作用（ P ＜0.05），对白首乌二苯酮、告达亭、青阳参苷元、去酰基萝藦苷元的吸收具有显著抑制作用（ P ＜0.05）。（图3-3，表3-7）

（八）讨论

通过比较6种成分在十二指肠、空肠、回肠和结肠中药物吸收速率常数和累积吸收转化率的差异，可见各种成分的最佳吸收部位并不相同。实验结果显示，青阳参苷元和去酰基萝藦苷元的最佳吸收部位在回肠，白首乌二苯酮的最佳吸收部位在十二指肠，东莨菪内酯的最佳吸收部位在空肠。目前关于隔山消各成分吸收机制的研究报道较少，有文献指出正常状态下丁香酸在人晶状体上皮细胞（HLEC）中的跨膜转运方式是主动地通过能量及网格蛋白载体介导的胞吞作用途径；东莨菪内酯在Caco-2细胞的吸收机制为被动扩散，但Caco-2细胞属于细胞水平实验，缺少部分代谢酶。本实验结果显示，灌流药液的浓度对各成分的吸收有一定影响，但是各成分影响趋势不一致。白首乌二苯酮的累积吸收转化率随浓度的增加而降低，其吸收机制可能为主动转运；其他几种成分可能为主、被动转运方式同时存在，或存在其他复杂的跨膜转运方式，与前期离体外翻肠囊实验结果总体一致。这在一定程度上佐证了离体外翻肠囊实验结果，亦为隔山消药材的深度开发与利用提供了参考依据。 7wsqmupY1WxZkS2mFJlJqQpigT0DAWUaFEXgIahlf/8/+4PHPNZ6xYym7AuOgFJA