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本部分拟从整体水平，进一步考察头花蓼提取物中主要成分的口服吸收特征。本部分以吸收量相对较大的没食子酸、原儿茶酸、槲皮苷为指标性成分，研究大鼠灌胃头花蓼提取物后3个指标成分的体内动力学特征，揭示其经时动态变化规律和消除特征，为临床合理用药的安全性和有效性提供实验依据。
Waters BEH C 18 色谱柱（2.1mm×100mm，1.7µm）；Waters Van Guard BEH C 18 保护柱（2.1mm×5mm，1.7µm）；柱温45℃；流动相0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；流速0.35mL/min；进样体积为2µL。梯度洗脱条件：0～1.5min，5%～30%（A）；1.5～3.0min，30%～90%（A）；3.0～4.0min，90%～5%（A）。
采用电喷雾电离源（ESI），毛细管电离电压3kV，离子源温度120℃；喷雾气与反吹气为氮气，去溶剂气流速650L/h，去溶剂气温度350℃，反吹气流速为650L/h；碰撞气为氩气，碰撞气流速0.16mL/min；扫描方式为多反应监测（MRM）。没食子酸等三种成分及内标用于定量分析的监测离子见表2-14。
表2-14 没食子酸等三种成分及内标的质谱条件
取大鼠血浆100µL，置于1.5mL塑料离心管中，补加50µL甲醇，加入10µL 20µg/mL内标溶液，加入50µL 1%甲酸，加入400µL甲醇，涡混1min，超声5min，4℃ 15000rpm离心5min，取上清液置离心管中，48℃下氮气吹干，残留物用200µL初始流动相溶解，超声5min，4℃ 15000rpm离心5min，取上清液进样UPLC-MS/MS分析。
选取健康SD大鼠6只，雌雄各半，体重为230±20g，给药剂量为4.8g/kg，给药前12h禁食，自由饮水。灌胃头花蓼提取物溶液后5min、10min、20min、30min、1h、1.5h、2h、3h、5h、7h、9h、12h经尾静脉取血约0.2mL，置于涂有肝素的塑料离心管中，4500rpm离心3min，分离得到血浆于-20℃冰箱中保存，备用。
测定未知样品时应进行质量控制，每批生物样品均需测定随行标准曲线，按“标准曲线”项下制备低、中、高浓度的质控样品。在每批生物样品测定时，随行测定三个浓度的质控样品。质控样品的测定数不应少于样本总量的5%。
采用DAS 2.0数据处理软件进行药代动力学参数计算和数据拟合。选取最小AIC值拟合房室模型， AUC 0→t 、 C max 等参数选用统计矩方法计算，并对 AUC 0→t 、 C max 进行方差分析，确定其动力学模型。
取100µL大鼠空白血浆，除不加内标并补加50µL甲醇外，其余按“三、血浆样品处理方法”项下方法操作，获得空白样品色谱图2-32A。将一定浓度的标准混合溶液和内标溶液加入空白血浆，同法操作，获得相应色谱图2-32B。取大鼠给药后30min血浆，同法操作，获得相应色谱图2-32C。在其选定的色谱条件和质谱条件下没食子酸，原儿茶酸及槲皮苷三种物质及内标葛根素监测离子反应分别为 m/z 169.0→125.0、 m/z 152.9→109.0、 m/z 449.2→303.1、 m/z 417.0→267.0。空白血浆、空白血浆加没食子酸等三种物质和大鼠给药后血浆样品色谱见图2-32，没食子酸等三种物质及内标的保留时间分别为0.67、1.01、1.83、1.32min，各成分间分离良好，未见血浆中杂质干扰。
图2-32 血浆的UPLC-MS/MS典型分析色谱图
A.空白血浆；B.空白血浆加对照品溶液；C.实测样品。
1.没食子酸；2.原儿茶酸；3.葛根素；4.槲皮苷。
分别精密吸取没食子酸等三种对照品储备液适量，用甲醇按梯度稀释至所需浓度，得混合系列标准溶液，置冰箱（-20℃）保存，备用。
取100µL大鼠空白血浆，依次加入混合标准溶液50µL，配制成相当于大鼠血浆药物浓度（表2-15）的样品，按“三、血浆样品处理方法”项下操作，建立标准曲线。以待测物的峰面积与内标峰面积之比（ A / A i ）为纵坐标 y ，各物质浓度（ C ）为横坐标 x 进行直线回归，权重系数为1/ x ，所得的直线方程，即为标准曲线。没食子酸等三种成分最低检测限（LLOD）定为S/N≥3。实验结果表明，大鼠血浆中没食子酸等三种成分在其线性范围内线性关系良好，各成分标准曲线相关系数（ r ）均大于0.99。大鼠标准曲线、最低检测限（LLOD）、最低定量限（LLOQ）见表2-16。
表2-15 大鼠含药血浆中的药物浓度
按“（二）标准曲线的制备”项下分别配制三种成分大鼠血浆高、中、低三个浓度的质量控制样品（QC），各浓度连续测定5天，计算日间精密度；各浓度平行配制5份，计算日内精密度；并与标准曲线同时进行，根据当日标准曲线计算QC样品的浓度，并与配制浓度对照，将QC样品的结果进行方差分析，求得本方法的精密度（QC样品测定值的标准偏差）与准确度（QC样品测定均值与真实值的相对误差），测定结果见表2-17。结果表明，没食子酸等三种成分的日内和日间精密度均小于10%，准确度范围为88.91%～98.75%，提示该方法准确、可靠、重现性好。
表2-16 没食子酸等三种成分在血浆中的线性关系
取100µL大鼠空白血浆，按“（二）标准曲线的制备”项下分别配制低、中、高三个浓度的质控样品（QC），每个浓度平行5份，按“三、血浆样品处理方法”项下操作（A样品）。另取100µL空白血浆，除不加混合标准溶液与内标外，其余按“三、血浆样品处理方法”项下操作，向获得的上清液中加入相应低、中、高浓度的混合标准溶液和内标，吹干，残留物以200µL初始流动相溶解（B样品）。另取上述低、中、高浓度的混合标准溶液与内标，吹干，残留物以200µL初始流动相溶解（C样品）。内标以同样方法进行考察。提取回收率计算方法为A样品与B样品色谱峰面积之比。基质效应计算方法为B样品与C样品的色谱峰面积之比。
低、中、高三个浓度下三种检测成分的基质效应和提取回收率结果见表2-17，内标的基质效应和提取回收率分别为93.5%和96.6%。实验结果表明提取回收率良好，不存在明显的基质效应。
表2-17 大鼠血浆样品准确度、精密度、提取物回收率、基质效应（
±
s
，
n
=5）
按“（二）标准曲线的制备”项下分别配制没食子酸等三种成分的大鼠血浆低、中、高三个浓度的质量控制样品（QC），样品处理后至自动进样器中，在0h、8h分别进样，以每一浓度3样本分析。结果表明，没食子酸等三种成分的处理后血浆样品在自动进样器中0h、8h均稳定，具体结果见表2-18。
同法配制低、中、高三个浓度的血浆样品（QC），分别在室温（约20℃）下放置8h，4℃下冷藏8h，反复冻融3次，以每一浓度3样本分析。结果表明，三种成分血浆样品在室温下放置8h、4℃下冷藏8h和经3次冻融循环均稳定，具体结果见表2-18。
表2-18 大鼠血浆样品稳定性（
±
s
，
n
=3）
给大鼠灌胃头花蓼提取物后，检测到没食子酸等三种成分的血药浓度见表2-19，平均血药浓度-时间曲线见图2-33。采用DAS2.0软件计算药动学参数并对药物在大鼠体内的动力学过程进行拟合，结果表明没食子酸等三种成分在大鼠体内的代谢过程符合二室模型，其相关药动学参数见表2-20。
表2-19 没食子酸等三种成分的血药浓度测定结果（
±
s
，
n
=6）
图2-33 大鼠口服头花蓼提取物后三种成分的 C - t 药时曲线（ n =6）
表2-20 没食子酸等三种成分在大鼠体内的主要药动学参数（
±
s
，
n
=6）
大鼠口服头花蓼提取物后，三种成分在体内均符合二室药动学模型。三种成分中没食子酸、原儿茶酸的达峰时间较短，分别为0.6、0.5h，均小于1h，而槲皮苷较长，说明大鼠口服头花蓼提取物后三种成分能够较为快速地进入体内，吸收和分布迅速，且没食子酸、原儿茶酸在体内吸收分布较槲皮苷块。三种成分在体内滞留时间较短， MRT 0→t 分别为2.88±0.53、2.29±0.33、4.52±1.3h，表明槲皮苷与没食子酸及原儿茶酸相比，其体内滞留时间较长，说明其在体内消除较慢；再比较槲皮苷的曲线下面积及达峰浓度，其值均较没食子酸、原儿茶酸小，说明其在体内的吸收较差。药动学参数结果表明，同一提取物中不同类别成分药动学参数存在一定差异，可能是因为口服给药后药物需要经胃肠道吸收后才能入血，而药物中不同成分在胃肠的吸收特征不同，其影响了药物在体内的暴露特征，从而对药物的动力学参数产生了影响。
由图2-33可看出，给药7h后槲皮苷的血药浓度-时间曲线出现“双峰”特征，推测槲皮苷在肠道的吸收可能存在肠肝循环现象，即药物被胃肠道吸收后，可能以原型或代谢物分泌进入胆汁，而后经胆总管进入肠道，经肠道细菌水解，其中一部分被肠重吸收，另一部分则被消除，重吸收的部分借进门静脉再次入肝，如此形成肝肠循环。此结果与文献中报道的黄酮类药物的药-时曲线多存在双峰现象较为一致。同时实验中利用质谱全扫描模式还发现了一些代谢产物，提示头花蓼在大鼠体内可能存在比较快速而广泛的生物转化，其代谢途径、代谢产物等信息还有待进一步研究证实。
没食子酸、原儿茶酸、杨梅苷、金丝桃苷和槲皮苷5种成分的3h百分吸收转化率（ A ）分别为44.9、59.4、32.0、47.8、36.1%；在提取物中的含量分别为8.58、0.28、0.31、0.42、2.96%。通过在体肠吸收实验结果表明，没食子酸等成分在小肠中均具有一定的吸收，原儿茶酸的吸收量较大，但在血浆中暴露量低，可能是其在提取物中含量较低所致，因此其绝对入血量少，血药浓度低。
槲皮素在头花蓼提取物中具有一定的量，但是经灌胃给予头花蓼提取物后的大鼠血浆中药物浓度极低，不易检测。经查阅文献，口服黄酮类化合物后在肠道及肝脏Ⅱ相代谢酶的作用下，可发生葡萄糖醛酸化和硫酸化反应，而槲皮素在血浆中主要以葡萄糖醛酸结合物的形式存在，因此在血浆中并未检测到原型。为进一步证实这一结论，了解其在体内的药动学过程，本实验对灌胃给予头花蓼提取物后大鼠的血浆样品进行酶水解，即利用β-葡萄糖醛酸酶预处理后再进行测定，使槲皮素的葡萄糖醛酸结合物水解为游离的单体，进而测定槲皮素的总浓度。结果发现，进行酶解后的血浆样品能产生大量槲皮素游离物，说明槲皮素的葡萄糖醛酸结合物是其在血浆中的主要形式，其在Ⅱ相代谢酶的作用下发生了代谢转化。