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本研究以头花蓼提取物为实验对象，收集健康SD大鼠给药后的血清、尿液、粪便及胆汁，采用超高压液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（UHPLCESI-Q-TOF/MS）联用技术对各生物样品进行检测，结合Metabolite Tools TM 及质量亏损过滤（MDF）等代谢产物预测、筛查技术，对经灌胃头花蓼提取物后大鼠的代谢产物进行快速分析，研究头花蓼提取物在大鼠体内的生物转化规律，推测药物中活性或潜在活性成分可能的代谢途径，为阐明头花蓼体内直接作用物质提供实验依据。
取头花蓼药材，加10倍量水煎煮3次，每次1h，过滤，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.05～1.07（50℃），加乙醇至溶液含醇量为65%，搅拌均匀，静置12h，抽滤，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.04～1.06（50℃），用1/2倍量水饱和的正丁醇提取3次，合并正丁醇液，减压回收正丁醇，残留物微波真空干燥，得头花蓼提取物，收膏率为2.3%。
Agilent Eclipse Plus C 18 RRHD色谱柱（2.1mm×100mm，1.8µm），柱温45℃。流动相0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）梯度洗脱，洗脱梯度见表2-12。进样体积为2µL。
表2-12 洗脱梯度表
电喷雾离子源（ESI），扫描方式为负离子扫描（ESI - ， m/z 50～1000），毛细管电压3kV，锥孔电压80V；离子源温度110℃；雾化气（N 2 ）压力1.2bar，流速8.0L/min，温度200℃；脱溶剂气温度300℃，雾化气体积流量50L/h，脱溶剂气体积流量550L/h。准确质量测定采用甲酸钠校正标准液，校正模式选用Enhanced Quadratic。数据分析用Metabolite Tools TM 软件、Data Analysis软件及MDF。
选取健康SD大鼠，雌雄各半，体重220±20g，正常饲养1周，以适应实验室环境。随机分为2组（给药组和空白组），每组6只。SD大鼠饲养于代谢笼中，给药前禁食12h，自由饮水。两组分别给予头花蓼提取物及蒸馏水，按每次87g/kg（生药量）剂量连续灌胃3天，每天2次，空白组灌胃等体积的蒸馏水。分别于末次给药后30min股动脉采血，取全血置于37℃恒温水浴上，至上层有黄色液体析出，取出后于台式冷冻离心机（5000rpm），4℃离心10min，取上层血清，置于-20℃保存，备用。
选取健康SD大鼠6只，雌雄各半，体重220±20g，正常饲养1周，以适应实验室环境。SD大鼠饲养于代谢笼中，给药前禁食12h，自由饮水。给予头花蓼提取物，按每次87g/kg（生药量）剂量连续灌胃3天，每天2次，分别收集不同时间段（0～2h、2～4h、4～8h、8～12h、12～24h、24～48h、48～72h）大鼠的尿液及粪便，粪便烘干后置于-20℃保存，备用。
另取健康SD大鼠6只，随机分为2组（给药组及空白组），手术前禁食12h，于乌拉坦麻醉状态下实施胆管插管手术，选用内径小的硅橡胶管（1.5mm），找到胆管（半透明，下部连有少量脂肪），剪开一小口插入胆管插管，固定胆管插管后缝合。将大鼠四肢固定于代谢笼上，同时保持胆汁顺畅流出。按87g/kg剂量给大鼠灌胃头花蓼提取物，空白组灌胃同等体积的蒸馏水。分段收集不同时间段（0～4h、4～12h、12～24h、24～48h）大鼠的胆汁。所收集的胆汁置于-20℃冰箱中保存，备用。
取大鼠血清、尿液、胆汁各0.5mL，分别置于5mL进口玻璃离心管中，补加4mL甲醇，涡混震荡2min，超声5min，台式冷冻离心机15000rpm离心10min，取上清液于37℃下N 2 吹干，加入1mL甲醇于吹干的样品中。按上述处理方法二次沉淀蛋白，加入300µL 50%甲醇水溶液溶解残留物，UHPLC-ESIQ-TOF/MS进样分析。
取烘干后大鼠粪便0.5g，用生理盐水制成25%的匀浆液，超声5min，5000rpm离心10min，分离上层液，取500µL匀浆液，补加甲醇1mL，涡混1min，超声5min，台式冷冻离心机15000rpm离心10min，上清液于37℃下N 2 吹干，加入0.5mL甲醇于吹干的样品中。按上述处理方法二次沉淀蛋白，残留物用300µL 50%甲醇水溶液溶解，UHPLC-ESI-Q-TOF/MS进样分析。
运用Metabolite Tools TM 将UHPLC-ESI-Q-TOF/MS采集的图谱进行处理，以MDF数据处理技术为基础，可以在复杂生物基质中快速检测药物代谢物。利用Metabolite Predict对头花蓼提取物中的多个原型单体成分进行代谢产物预测，将生成的代谢产物Mass List导入Metabolite Detect中，得到生物样品和空白样品的差异图谱，将差异图谱与Mass List匹配，进而得到其可能的代谢产物，依此推测出头花蓼提取物中各成分在体内可能的代谢途径，从而反映头花蓼提取物的体内代谢整体特征。
利用Metabolite Detect得到空白血清、含药血清及两者差异图谱（图2-23），各成分在ESI - 模式下得到较好的响应信号。
图2-23 头花蓼提取物在大鼠血清中的代谢产物ESI - 总离子流图
A.空白血清；B.含药血清；C.空白血清与含药血清差异图谱。
1.原型成分鉴定 由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在1.6min处存在 m/z 169.0149［M-H］ - 峰的化合物，显示125.0244［M-H-COO］ - 的主要碎片离子峰，与没食子酸对照品相同，由此确定 T R 1.6min的M1为没食子酸。
由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在2.5min处存在 m/z 153.0192［M-H］ - 峰的化合物，显示109.0295［M-H-COO］ - 的主要碎片离子峰，与原儿茶酸对照品相同，由此确定 T R 2.5min的M3为原儿茶酸。
由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在5.3min处存在 m/z 463.0888［M-H］ - 峰的化合物，显示301.0361［M-H-C 6 H 10 O 5 ］ - 的主要碎片离子峰，与陆地棉苷对照品相同，由此确定 T R 5.3min的M5为陆地棉苷。
由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在5.4min处存在 m/z 463.0872［M-H］ - 峰的化合物，显示301.0353［M-H-C 6 H 10 O 5 ］ - 的主要碎片离子峰，与金丝桃苷对照品相同，由此确定 T R 5.4min的M7为金丝桃苷。
由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在6.1min处存在 m/z 447.0937［M-H］ - 峰的化合物，显示301.0349［M-H-C 6 H 10 O 4 ］ - 的主要碎片离子峰，与槲皮苷对照品相同，由此确定 T R 6.1min的M10为槲皮苷。
2.甲基硫酸化代谢产物鉴定 由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在2.2min处存在 m/z 262.9868［M-H］ - 峰的化合物，显示183.0286［M-H-SO 3 ］ - 、125.0246［M-H-SO 3 -COO-CH 2 ］ - 的主要碎片离子峰，由Smart Formula预测其化学式为C 8 H 7 O 8 S，推测 T R 2.2 min的M2为没食子酸甲基硫酸化代谢产物。
3.双硫酸化代谢产物鉴定 由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在5.1min处存在 m/z 461.1846［M-H］ - 峰的化合物，显示301.0349［M-H-SO 3 -SO 3 ］ - 的主要碎片离子峰，由Smart Formula预测其化学式为C 15 H 9 O 13 S 2 ，且其保留时间较槲皮素缩短，亲水性增加，推测 T R 5.1 min的M4为槲皮素双硫酸化代谢产物。
4.葡萄糖醛酸化代谢产物鉴定 由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在5.4min处存在 m/z 477.0675［M-H］ - 峰的化合物，由Smart Formula预测其化学式为C 21 H 17 O 13 ，且其保留时间较槲皮素缩短，亲水性增加，推测 T R 5.4min的M6为槲皮素葡萄糖醛酸化代谢产物。
5.甲基葡萄糖醛酸化代谢产物鉴定 由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在5.8、5.9min处分别存在 m/z 491.1898、491.1837［M-H］ - 峰的化合物，显示477.1763［M-H-CH 2 ］ - 的主要碎片离子峰，由Smart Formula预测两者的化学式均为C 22 H 19 O 13 ，推测 T R 5.8、5.9min的M8、M9为槲皮素甲基葡萄糖醛酸化代谢产物。
6.二甲基葡萄糖醛酸化代谢产物鉴定 由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在6.7、8.2min处分别存在 m/z 505.0980、505.0966［M-H］ - 峰的化合物，显示329.0676［M-H-C 6 H 8 O 6 ］ - 的主要碎片离子峰，由Smart Formula预测两者的化学式均为C 23 H 21 O 13 ，推测 T R 6.7、8.2min的M11、M14为槲皮素二甲基葡萄糖醛酸化代谢产物。
7.三甲基葡萄糖醛酸化代谢产物鉴定 由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在7.3、7.8、8.7min处分别存在 m/z 519.0784、519.0761、519.0766［MH］ - 峰的化合物，显示343.0441［M-H-C 6 H 8 O 6 ］ - 的主要碎片离子峰，由Smart Formula预测三者的化学式均为C 24 H 23 O 13 ，推测 T R 7.3、7.8、8.7min的M12、M13、M15为槲皮素三甲基葡萄糖醛酸化代谢产物。
8.二甲基化代谢产物鉴定 由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在9.1、9.8min处分别存在 m/z 329.0664、329.0675［M-H］ - 峰的化合物，由Smart Formula预测两者的化学式均为C 17 H 13 O 7 ，且其保留时间较槲皮素延长，疏水性增加，推测 T R 9.1、9.8min的M16、M17为槲皮素二甲基化代谢产物。
9.三甲基化代谢产物鉴定 由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在11.8min处存在 m/z 343.0822［M-H］ - 峰的化合物，由Smart Formula预测其化学式为C 18 H 15 O 7 ，且其保留时间较槲皮素及槲皮素二甲基化代谢产物延长，疏水性增加，推测 T R 11.8min的M18为槲皮素三甲基化代谢产物。
利用Metabolite Detect得到空白尿液、含药尿液及两者差异图谱（图2-24），各成分在ESI - 模式下得到较好的响应信号。
图2-24 头花蓼提取物在大鼠尿液中的代谢产物ESI - 总离子流图
A.空白尿液；B.含药尿液；C.空白尿液与含药尿液差异图谱。
1.原型成分鉴定 由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在8.0min处存在 m/z 301.0351［M-H］ - 峰的化合物，与槲皮素对照品相同，由此确定 T R 8.0min的M23为槲皮素。
原型成分M3、M10分析见“（一）1”项。
2.硫酸化代谢产物鉴定 由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在1.3、1.5min处分别存在 m/z 248.9702、248.9694［M-H］ - 峰的化合物，显示169.0138［M-H-SO 3 ］ - 、125.0240［M-H-SO 3 -COO］ - 的主要碎片离子峰，由Smart Formula预测两者的化学式均为C 7 H 5 O 8 S，且其保留时间较没食子酸缩短，亲水性增加，推测 T R 1.3、1.5min的M19、M20为没食子酸硫酸化代谢产物。
由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在1.7min处存在 m/z 232.9756［M-H］ - 峰的化合物，显示153.0182［M-H-SO 3 ］ - 的主要碎片离子峰，由Smart Formula预测其化学式为C 7 H 5 O 7 S，且其保留时间较原儿茶酸缩短，亲水性增加，推测 T R 1.7min的M21为原儿茶酸硫酸化代谢产物。
3.甲基硫酸化代谢产物鉴定 由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在1.9、2.2min处分别存在 m/z 262.9858、262.9860［M-H］ - 峰的化合物，显示183.0297［M-H-SO 3 ］ - 、125.0246［M-H-SO 3 -COO-CH 2 ］ - 的主要碎片离子峰，由Smart Formula预测两者的化学式为C 8 H 7 O 8 S，推测 T R 1.9、2.2min的M22、M2为没食子酸甲基硫酸化代谢产物。
4.双硫酸化代谢产物鉴定 代谢产物M4分析见“（一）3”项。
5.葡萄糖醛酸化代谢产物鉴定 代谢产物M6分析见“（一）4”项。
6.甲基葡萄糖醛酸化代谢产物鉴定 代谢产物M8分析见“（一）5”项。
7.二甲基葡萄糖醛酸化代谢产物鉴定 代谢产物M11、M14分析见“（一）6”项。
8.三甲基葡萄糖醛酸化代谢产物鉴定 由Metabolite Detect得到的差异图谱中可知，在7.8、8.1、8.7min处分别存在 m/z 519.0786、519.0779、519.0771［MH］ - 峰的化合物，显示343.0439 ［M-H-C 6 H 8 O 6 ］ - 的主要碎片离子峰，由Smart Formula预测三者的化学式均为C 24 H 23 O 13 ，推测 T R 7.8、8.1、8.7min的M13、M24、M15为槲皮素三甲基葡萄糖醛酸化代谢产物。
9.二甲基化代谢产物鉴定 代谢产物M16分析见“（一）8”项。
10.三甲基化代谢产物鉴定 代谢产物M18分析见“（一）9”项。
利用Metabolite Detect得到空白粪便、含药粪便及两者差异图谱（图2-25），各成分在ESI - 模式下得到较好的响应信号。
图2-25 头花蓼提取物在大鼠粪便中的代谢产物ESI - 总离子流图
A.空白粪便；B.含药粪便；C.空白粪便与含药粪便差异图谱。
利用Metabolite Detect得到空白胆汁、含药胆汁及两者差异图谱（图2-26），各成分在ESI - 模式下得到较好的响应信号。
图2-26 头花蓼提取物在大鼠胆汁中的代谢产物ESI - 总离子流图
A.空白胆汁；B.含药胆汁；C.空白胆汁与含胆汁便差异图谱。
利用Metabolite Detect处理后，得到头花蓼提取物在大鼠血清、尿液、粪便及胆汁中的主要代谢产物信息见表2-13。
表2-13 UHPLC-ESI-Q-TOF/MS检测大鼠口服头花蓼提取物后在血清、尿液、粪便、胆汁中的主要代谢产物
（续表）
注：P.血清；U.尿液；F.粪便；B.胆汁。
图2-27 头花蓼提取物中槲皮素的主要代谢产物及可能的代谢途径
1.葡萄糖醛酸化；2.甲基化；3.硫酸化；4.二硫酸化；5 二甲基化；6.O-C2键开环裂解；P.血清；U.尿液；F.粪便；B.胆汁。
图2-28 头花蓼提取物中槲皮苷的主要代谢产物及可能的代谢途径
1.甲基化；2.葡萄糖醛酸化；P.血清；U.尿液；F.粪便；B.胆汁。
图2-29 头花蓼提取物中原型成分陆地棉苷和金丝桃苷
P.血清；U.尿液；F.粪便；B.胆汁。
图2-30 头花蓼提取物中没食子酸的主要代谢产物及可能的代谢途径
1.硫酸化；2.甲基化；3.二甲基化；P.血清；U.尿液；F.粪便；B.胆汁。
图2-31 头花蓼提取物中原儿茶酸的主要代谢产物及可能的代谢途径
1.甲基化；2.二甲基化；3.硫酸化；P.血清；U.尿液；F.粪便；B.胆汁。
在中药代谢研究领域中，对海量的复杂的代谢数据的分析处理既是重点也是难点。因此，本研究运用Metabolite Tools TM 布鲁克数据处理工具对代谢信息进行分析。其中Metabolite Predict含有Metabolite Rules（代谢途径库），可以根据药物中原型成分的结构特征及其在体内可能发生的代谢变化选择相应的代谢途径，由此Metabolite Predict则会预测出庞大的代谢产物Mass List。将Mass List导入Metabolite Detect中，与差异图谱进行匹配，通过差异分析并结合MDF技术来寻找可能的代谢产物并对其进行定性。MDF是一种用于代谢数据处理的技术，它能将LC-MS采集的高分辨数据和预先设定的代谢产物的质量亏损数据通过软件处理来推测目标代谢物。UPLC-Q-TOF/MS和相应的处理软件结合使用，能够更好地提高效率，获得更加丰富的信息；而其作为中药代谢研究的实用模式，也被认为是代谢研究的“第一线”方法。
本实验在大鼠体内共检测分析出41个代谢产物峰，其中血清、尿液、粪便、胆汁分别为17、18、12、19个（含交叉成分）。血清样品中检测到大量没食子酸原型成分，其次主要以槲皮苷原型成分、槲皮素三甲基葡萄糖醛酸化产物为主，同时也检测到少量原儿茶酸、陆地棉苷、金丝桃苷原型成分，还存在以槲皮素为主发生甲基化、葡萄糖醛酸化、甲基葡萄糖醛酸化反应的多个代谢产物。尿液样品中以酚酸类成分的硫酸化反应、槲皮素甲基葡萄糖醛酸化反应为主，同时检测到槲皮苷、槲皮素原型成分，还存在以槲皮素为主发生甲基化、葡萄糖醛酸化、甲基葡萄糖醛酸化反应的多个代谢产物。粪便样品中检测到大量酚酸类成分的甲基化产物及槲皮素O-C 2 键开环裂解产物，同时也检测到大量的槲皮素、槲皮苷原型成分。胆汁样品中检测到大量槲皮素三甲基葡萄糖醛酸化产物及槲皮苷原型成分，其次主要以槲皮苷甲基葡萄糖醛酸化、槲皮素甲基葡萄糖醛酸化产物为主。
本部分以头花蓼提取物为研究对象，给大鼠灌胃后收集其血清、尿液、粪便、胆汁。结果表明，头花蓼提取物能在其体内发生生物转化，其代谢产物以槲皮素葡萄糖醛酸化、甲基葡萄糖醛酸化、硫酸化为主，揭示头花蓼提取物经口服吸收进入体内后主要以槲皮素的葡萄糖醛酸、硫酸及甲基化代谢反应为主。