第三节
组织分布研究

本实验根据药代动力学研究的实验结果，选取3个时间点（口服给药后15、120、360min）分别代表分布相、平衡相、消除相，观察口服给予头花蓼提取物后各成分在大鼠体内各脏器组织中的分布特征。

一、溶液的配制

（一）三种指标成分标准溶液的配制

精密称取没食子酸标准品、原儿茶酸标准品及槲皮苷标准品适量，用甲醇定容至10mL，获得没食子酸（1.018mg/mL）、原儿茶酸（0.831mg/mL）和槲皮苷（0.426mg/mL）的储备液。分别精密量取3种标准品储备溶液适量，用甲醇按梯度稀释到实验所需浓度，即得到混合系列标准溶液，置于冰箱（-20℃）保存，备用。

（二）内标溶液的配制

精密称取葛根素标准品11.05mg，用甲醇定容至25mL，获得葛根素（0.442mg/mL）的储备液。取内标储备液适量，用甲醇定容至10mL，配制成5.5µg/mL的内标溶液，置冰箱下层（-20℃）保存，备用。

（三）肝素钠溶液（50U/mL）的配制

精密称取0.036g肝素钠粉末，用生理盐水定容至10mL，获得母液。再取1mL母液，用生理盐水定容至10mL，即得到50U/mL的肝素钠溶液，临用前配制。

二、色谱条件

Waters BEH C 18 色谱柱（2.1mm×100mm，1.7µm）；Waters Vanguard BEH C 18 保护柱（2.1mm×5mm，1.7µm）柱温45℃。流动相为0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），流速为0.35mL/min，进样体积为5µL。梯度洗脱条件见表2-9。

三、质谱条件

采用电喷雾电离源，毛细管电离电压3kV，离子源温度120℃；喷雾气与反吹气为N 2 ，去溶剂气流速为650L/h，去溶剂气温度350℃，扫描方式为多反应离子监测（MRM），质谱数据采集及处理软件为MassLynx V4.1工作站。没食子酸等三种成分及葛根素内标用于定量分析的监测离子见表2-10。

四、组织样品处理方法

精密称取各组织，并按重量用冰生理盐水在玻璃匀浆器中匀浆，制成50%匀浆液。以不给药的相应组织匀浆作为空白匀浆液。将匀浆液超声（5min），离心（5000rpm，8min），取上层匀浆液500µL，置5mL于EP管中，补加甲醇50µL，分别加入20µL葛根素内标溶液（22.8µg/mL）、1%甲酸250µL、甲醇2mL，涡旋混匀（3min），超声（10min），离心（12000rpm，10min）后取上清液置EP管中，N 2 下吹干（37℃）。150µL初始流动相溶解残留物，涡旋混匀（3min）、超声（10min），离心（12000rpm，10min），取上清液待测。

五、实验方法及样品测定

正常SD大鼠15只，体重为220～250g，分为三组（15min、120min和360min三个时间点），给药前12h禁食，自由饮水。口服给予头花蓼提取物，给药剂量为10g/kg。分别于给药后15min、120min和360min三个时间点股动脉放血，然后迅速取出肾、肝、肺、脾、心、胃、肌肉、小肠、脑等组织。用冰生理盐水将组织表面的血迹及内容物洗去，并用滤纸将其沾干，装入自封袋中，冰冻（-20℃）保存，备用。

从冰箱（-20℃）中取出大鼠组织匀浆样品，室温解冻后按“四、组织样品处理方法”项下操作进行，每批次样品都同时测定随行标准曲线。在每批测定时随行测定低、中、高三种不同浓度的质控（QC）样品，且每种浓度的质控样品都进行双份样本分析。质控样品的测定数不低于样本总量的5%。记录所有样品的各待测成分和葛根素内标的峰面积，将其带入随行标准曲线中，计算出质控样品和各待测成分的浓度。当随行标准曲线和质控样品都符合生物样品的测定要求时，计算得到的各待测成分的浓度才被接受。

六、分析方法的考察

（一）专属性考察

取500µL大鼠空白组织匀浆液（肾、肝、肺、脾、心、胃、肌肉、小肠及脑），按“四、组织样品处理方法”项下操作（不加内标），获得空白样品A色谱图。将一定浓度的对照品溶液和葛根素内标溶液加入空白组织匀浆液中，依同法操作，获得B色谱图。取大鼠给药后的组织匀浆液，依据同样操作方法获得C色谱图。

在选定的色谱和质谱条件下，监测离子反应分别为 m/z 169.0→125.0（没食子酸）、 m/z 152.9→109.0（原儿茶酸）、 m/z 449.2→303.1（槲皮苷）、 m/z 417.0→267.0（葛根素）。各成分间分离良好，组织匀浆液中无杂质干扰，获得空白组织匀浆液、空白组织匀浆液加入混合对照品溶液和葛根素内标溶液，以及大鼠给药后组织匀浆液样品色谱图（图2-13～2-21）。

（二）标准曲线的制备

取500µL大鼠空白组织匀浆液，依次加入含有没食子酸等三种成分的混合系列标准溶液50µL，将溶液按“四、组织样品处理方法”项下操作。以待测成分与相应葛根素内标峰面积之比（ A / A i ）为纵坐标（ y ），各物质浓度（ C ）为横坐标（ x ）进线性回归，权重系数为1/ x ，得到的直线方程，即为标准曲线。

大鼠组织匀浆液中三种成分在线性范围内线性关系良好，各成分的标准曲线相关系数（ R 2 ）均大于0.99。典型大鼠组织匀浆液标准曲线方程及定量限（LOQ）见表2-11。

（三）准确度和精密度

按“（二）标准曲线的制备”项下分别配制三种成分大鼠组织匀浆液低、中、高浓度的QC样品，对每种浓度的5份样本进行分析，1日内连续进样，三种不同浓度连续测定3日，分别求算该方法的日内精密度和日间精密度。

通过对低、中、高三个浓度的大鼠组织匀浆液的日内精密度和日间精密度进行考察，结果表明没食子酸等三种成分的日内精密度和日间精密度均小于20%，准确度范围为86.75%～111.57%，提示该方法准确、可靠、重现性好。

（四）提取回收率

分别配制A、B、C三种样品。取500µL大鼠空白组织匀浆液，按“（二）标准曲线的制备”项下操作分别配制没食子酸等三种成分的大鼠组织匀浆液高浓度的QC样品，同时平行进行5份样本分析，具体操作参照“四、组织样品处理方法”（A样品）。另取500µL空白组织匀浆液，除不加混合对照品溶液外，其余按“四、组织样品处理方法”操作。在离心后获得的上清液中，加入相应浓度的对照品溶液（每种浓度进行5份样本分析），N 2 下吹干（37℃），加入150µL甲醇溶解残留物（B样品）。提取回收率计算方法为样品B峰面积与样品A峰面积之比。内标溶液同样进行考察。

通过对没食子酸等三种成分线性范围内高浓度的各组织匀浆液样品提取回收率进行考察，得出各成分的回收率分别为没食子酸84.12%～95.89%、原儿茶酸85.99%～94.09%、槲皮苷85.36%～94.37%、葛根素89.03%～95.88%。

（五）稳定性考察

以空白组织匀浆液按“（二）标准曲线的制备”方法分别配制低、中、高三个浓度的QC样品，每个浓度配制3份样本，分别在室温（约20℃）下放置24h、冷藏（4℃）24h和反复冻融循环3次。将处理后样品进样检测浓度，以考察大鼠各组织匀浆液中没食子酸等三种成分在室温、冷藏、反复冻融条件下的稳定性。

通过对没食子酸等三种成分低、中、高三个QC浓度各组织匀浆液样品在室温（约20℃）下放置24h、冷藏（4℃）24h和冻融三次的稳定性进行考察，结果表明三种成分在各组织的匀浆液样品，放置在室温下24h、冷藏24h和反复冻融3次后均稳定。

（六）组织分布实验结果

给予大鼠灌胃头花蓼提取物溶液后，监测没食子酸等三种成分在大鼠体内不同时间点（15、120、360min）在不同器官的分布情况，见图2-22。

1.没食子酸在大鼠体内不同时间点的组织分布情况

15min：肾＞胃＞小肠＞肝＞肺＞脾＞肌肉＞脑。

120min：小肠＞胃＞肾＞肺＞肝＞肌肉＞脑＞脾。

360min：小肠＞胃＞肾＞肝＞肺＞脾＞肌肉＞脑。

2.原儿茶酸在大鼠体内不同时间点的组织分布情况

15min：小肠＞肾＞胃＞肝＞肺＞脾＞肌肉＞心。

120min：小肠＞胃＞肾＞肝＞肺＞心＞肌肉＞脾。

360min：小肠＞胃＞肾＞肝＞肺＞心＞脾＞肌肉。

3.槲皮苷在大鼠体内不同时间点的组织分布情况

15min：小肠＞胃＞肝＞肺＞肾＞肌肉＞脾。

120min：小肠＞胃＞肺＞肝＞肌肉＞肾＞脾。

360min：小肠＞胃＞肝＞肌肉＞肺＞肾＞脾。

（七）讨论

药物经口服吸收进入机体后，随着血液循环到达各个组织器官。药物的分布特征除了与机体各部位的生理特征有关外，还与组织亲和力、药物本身的理化因素等密切相关。这些都将使药物在体内各组织器官中的分布产生差异，从而影响其疗效、蓄积及毒副作用。通过了解药物的组织分布特性，有利于了解其作用的靶器官，预测其药理作用，而这对扩大药物的临床应用范围有着重要意义。

本实验根据药-时曲线及预实验结果选取吸收相、平衡相和消除相三个时间点进行组织分布实验，因考虑到没食子酸等三个指标成分的达峰时间均在20min左右，并且模型鼠的吸收较正常快，故选取15min时间点为吸收相，达峰时间之后的120min为平衡相。实验设计之初，主要考虑到没食子酸等三个指标成分在模型鼠体内的暴露量增多，为了解各组织中的蓄积情况，故延长时间选取360min为消除相。但从正式实验结果可以看出，本实验的时间点设置过宽。因此，为更好地掌握没食子酸等成分的分布特征，在后期研究中应相应增加血液组并增设60min时间点。

本实验研究了大鼠灌胃头花蓼提取物后三个时间点的组织分布情况。结果显示，在给药15min时，各组织中均能检测到没食子酸等三种成分，说明头花蓼提取物中主要成分分布速度较快且范围广泛。其中各成分在小肠、胃、肾中的分布浓度较高，因其是主要的吸收和排泄器官；其次是肝，因其是主要的代谢器官；没食子酸在脑中分布较少，原儿茶酸和槲皮苷在脑中浓度低于定量下限，提示各成分较难通过血脑屏障。三种主要成分在心、脾、肺中的浓度较低，可能是由于没食子酸等与这三个组织的亲和力低。 AwaRCJoqwBEFjCrI3YL9jjy0WwKAEsJwP+m9pFhJUy2K44FSmLuxax+BnzYAOzSW