第二节
吸收研究

一、头花蓼提取物在Caco-2细胞的吸收特性研究

（一）头花蓼提取物的制备

称取头花蓼药材适量，加10倍量水，煎煮3次，每次1h，过滤，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.05～1.07（50℃），加乙醇至溶液含醇量为65%，搅拌均匀，静置12h，抽取滤液。滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.04～1.06（50℃），用1/2倍量水饱和的正丁醇提取3次，合并正丁醇液，减压回收正丁醇，残留物微波真空干燥，得到头花蓼提取物，收膏率为2.3%。

（二）实验方法

本实验利用体外细胞模型Caco-2细胞筛选中药的吸收成分（群），将中药中大量不能被吸收的复杂成分在体外实验前先行“筛”去，再与中药的原有成分比较分析，明确可被吸收成分，为中药质量评价指标成分的选取提供依据。同时，借助超高效液相色谱-高分辨电喷雾四级杆-飞行时间质谱仪（UHPLCESI-Q-TOF）对头花蓼提取物透过细胞膜的可被吸收成分进行分析，通过与对照品进行比对的基础上确定透过细胞膜进入细胞内的可被吸收成分，并在此基础上考察不同浓度、时间、温度、pH对可被吸收成分吸收的影响。由此获得各成分在单层细胞膜上的吸收机制、影响吸收的因素等相关信息，为头花蓼提取物的口服剂型研究提供理论依据。

1.色谱条件

（1）UHPLC液相条件 Agilent Eclipse Plus C 18 色谱柱（2.1mm×100mm，1.8µm），柱温为40℃。流动相为0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），流速为0.30mL/min，进样体积为1µL。梯度洗脱条件：0～10min，5%～21%（A）；10～13min，21%～30%（A）；13～14min，30%～50%（A）；14～15min，50%～90%（A）；15～17min，95%（A）；17～18min，95%～5%（A）。

（2）UPLC液相条件 Waters BEH C 18 色谱柱（2.1mm×100mm，1.7µm）；Waters Vanguard BEH C 18 保护柱（2.1mm×5mm，1.7µm）；柱温为45℃。流动相为0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），流速为0.35mL/min，进样体积为1µL。梯度洗脱条件：0～1.5min，5%～30%（A）；1.5～3.0min，30%～90%（A）；3.0～4.0min，90%～5%（A）。

2.质谱条件

（1）UHPLC-Q-TOF质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），在正离子模式下采集数据，数据采集范围 m/z 100～1000；毛细管电压4500V；雾化气N 2 ，雾化气压力1.2bar；去溶剂气N 2 ，去溶剂气流速8L/min，去溶剂气温度200℃；质谱数据采集及处理软件为Compass 1.2。

（2）UPLC-MS/MS质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；毛细管电离电压3kV；离子源温度120℃；去溶剂气N 2 ，流速650L/h，去溶剂气温度350℃；反吹气N 2 ，流速50L/h；碰撞气为氩气，流速0.16mL/min；质谱数据采集及处理软件为MassLynx V4.1工作站，扫描方式为多反应离子监测（MRM）模式，离子对条件见表2-1。6种检测成分及内标的质谱棒状图见图2-1。

（三）细胞裂解液中摄取成分的UHPLC-Q-TOF分析

通过比较空白裂解液样品、细胞摄取液样品和头花蓼提取物样品图谱（图2-2），结果表明头花蓼提取物中的主要成分能够透过细胞膜进入细胞内而被吸收。通过对高分辨质谱数据进行分析，并与已知头花蓼化学成分数据库进行比对，以准确质量数及同位素峰比例为依据对化学成分进行元素匹配，对细胞摄取液样品中的化学成分进行初步鉴别与归属。最后通过与相应对照品进行比较，指认出细胞摄取液中的6个色谱峰。高分辨质谱棒状图见图2-2。6个色谱峰的准确分子量等信息见表2-2。

（四）不同浓度受试化合物对Caco-2细胞的毒性研究

1.空白溶剂DMSO对Caco-2细胞的毒性 选取对数生长期Caco-2细胞，以（10～20）×10 4 /mL接种于96孔培养板中，每孔100µL。将培养板置于37℃、5% CO 2 培养箱中孵育24h。实验分为正常对照组、DMSO组［将DMSO稀释至不同体积比浓度：2.5‰、5‰、10‰、20‰、30‰（ V / V ）］。实验结果见图2-3。结果表明在所设置浓度范围内，空白溶剂DMSO对Caco-2细胞生长没有影响。

2.不同pH值HBSS缓冲液在不同时间对Caco-2细胞的毒性 选取对数生长期Caco-2细胞，以每孔100μL，（10～20）×10 4 /mL种植于96孔培养板中，将培养板置于37℃、5%CO 2 培养箱中孵育24h。实验分为正常对照组、不同pH值（4.0、6.0、7.4）HBSS缓冲液组。每个浓度平行5孔，实验重复3次，并计算细胞存活率。实验结果见图2-4。结果表明所用不同pH值的HBSS缓冲溶液对Caco-2细胞生长没有影响。

3.不同浓度维拉帕米、头孢菌素A对Caco-2细胞的毒性 选取对数生长期Caco-2细胞，以每孔100µL，（10～20）×10 4 /mL种植于96孔培养板中，将培养板置于37℃、5% CO 2 培养箱中孵育24h。实验分为正常对照组、不同浓度维拉帕米（25、50、100、200、400µg/mL）组和不同浓度头孢菌素A（5、25、50、100、200µg/mL）组。实验结果见图2-5。结果表明在所设浓度范围内维拉帕米、头孢菌素A对Caco-2细胞生长没有影响，可用于摄取实验。

4.不同浓度头花蓼提取物对Caco-2细胞的毒性 选取对数生长期Caco-2细胞，以每孔100µL，（10～20）×10 4 /mL种植于96孔培养板中，将培养板置于37℃、5%CO 2 培养箱中孵育24h。实验分为正常对照组、不同浓度头花蓼提取物（0.5、5、10、20、30mg/mL）组。实验结果见图2-6。结果表明在所设置的浓度范围内，随着浓度的增加，头花蓼提取物具有促进Caco-2细胞生长的作用（ P ＜0.05），可以进行下一步的摄取实验。

（五）细胞摄取影响因素考察

将培养14d的细胞用37℃、pH值7.4的HBSS缓冲溶液在培养箱中培养20min后，吸去缓冲溶液。用HBSS缓冲溶液轻轻冲洗两遍，洗去细胞单分子层表面的杂质，加入含药的HBSS溶液2mL，分别考察不同培养时间（15、30、60、90、120、180min）、不同浓度（0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mg/mL）、培养基不同pH值（4.0、6.0、7.4），以及不同P-gp抑制剂（维拉帕米、环孢菌素A）对头花蓼提取物细胞摄取的影响。置于37℃的培养箱中分别培养1h，取出后，加入4℃的HBSS缓冲液终止受试化合物的细胞摄取实验，并快速清洗三遍细胞单分子层。加入1% Triton X-100细胞裂解液500µL反复冻融裂解细胞，取出细胞超声10min，得细胞悬液。一部分加入600µL甲醇沉淀蛋白，涡旋离心，取上清液进样，采用UPLC-MS/MS法测定受试化合物含量，另一部分用考马斯亮蓝法测定细胞蛋白含量，按样品处理法操作。

（六）头花蓼提取物在Caco-2细胞的摄取实验

1.浓度对Caco-2细胞摄取的影响 取不同浓度（0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mg/mL）的头花蓼提取物的Hank's溶液2mL（ n =3），加入Caco-2细胞中，培养1h，考察药物浓度对细胞摄取的影响。结果显示，0.2～5mg/mL浓度的头花蓼提取物中的没食子酸、原儿茶酸、杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷及槲皮素6种成分的细胞摄取量与浓度呈线性关系，回归方程分别为 y =2.9695 x -0.9821， r =0.9952； y =0.1581 x -0.0198， r =0.9970； y =0.0425 x -0.0032， r =0.9923； y =0.0748 x -0.0111， r =0.9909； y =0.3576 x -0.0772， r =0.9962； y =0.5645 x +0.0434， r =0.9933。表明没食子酸等6种成分的摄取主要表现为被动扩散，如图2-7所示。

2.时间对Caco-2细胞摄取的影响 将2mg/mL头花蓼提取物加入培养好的细胞中，分别考察不同摄取时间（15、30、60、90、120、180min）对Caco-2细胞摄取头花蓼提取物的影响。结果表明，在不同的摄取时间下，头花蓼提取物中的没食子酸、金丝桃苷、杨梅苷、槲皮苷和槲皮素5种成分的细胞摄取量都随着时间的增加而增加，而原儿茶酸的细胞摄取量则随着时间的增加而降低，可能是因为原儿茶酸的摄取过程中有P-gp的参与，从而使细胞摄取量逐渐降低。综合分析认为，本实验宜将细胞摄取时间定为60min，如图2-8所示。

3.pH对头花蓼提取物摄取的影响 将2mg/mL头花蓼提取物分别溶于不同pH值（4.0、6.0、7.4）的Hank's溶液中，分别在加药60min后测定不同pH对Caco-2细胞摄取头花蓼提取物的影响。结果显示，在pH值4.0、6.0、7.4的条件下，头花蓼提取物中的原儿茶酸细胞摄取量随pH值的增加而先增加后降低，没食子酸、杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素5种成分的细胞摄取量随pH增加而降低；在酸性条件下有利于6种成分的摄取，在中性、偏碱性条件下，各成分的摄取量明显降低，表明碱性条件相对不利没食子酸等6种成分的吸收，如图2-9所示。

4.温度对头花蓼提取物摄取的影响 将2mg/mL头花蓼提取物加入培养好的细胞中，分别在加药60min后测定不同温度（4、25、37℃）对Caco-2细胞摄取头花蓼提取物的影响。结果表明，在不同温度下，头花蓼提取物中没食子酸、原儿茶酸、杨梅苷、金丝桃苷和槲皮苷5种成分的细胞摄取量都随着温度的增加而增加（ P ＜0.05）；槲皮素在25℃时的摄取量最高，但不具显著性差异，如图2-10所示。

5.P-gp抑制剂对头花蓼提取物摄取的影响 按药物摄取方法操作，在pH值为6、37℃、作用60min条件下，分别加入含维拉帕米（50µg/mL）的头花蓼提取物（2mg/mL）溶液，以及环孢菌素A（10µg/mL）的头花蓼提取物（2mg/mL）溶液，分别于给药60min后测定有无抑制剂存在时Caco-2细胞对头花蓼提取物摄取的变化。采用SPSS 18.0软件，统计采用单因素方差分析，如图2-11所示。结果表明原儿茶酸在环孢素A和维拉帕米作用下其摄取量显著增加（ P ＜0.05），推测其可能为P-gp底物。而环孢菌素A和维拉帕米对没食子酸、杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素的摄取量没有显著增加作用（ P ＞0.05），说明没食子酸等5种成分的摄取过程中没有P-gp参与，即没食子酸、杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素不是P-gp底物。

（七）讨论

近年来多有文献报道，采用体外Caco-2细胞模型获取药物透过细胞膜的可被吸收成分，能为中药指标性成分的筛选提供参考。因此，本部分实验采用UHPLC-Q-TOF对细胞摄取液及提取物中的成分进行分析，并通过与对照品进行比对，确认细胞摄取液中的可被吸收成分，为后续细胞吸收特性的研究中的指标成分的选择提供了实验依据。

本实验采用Caco-2细胞模型，以细胞摄取成分为指标性成分，结合运用UPLC-MS/MS法考察头花蓼提取物中主要活性成分的细胞摄取量与其浓度、培养基的温度、pH值、摄取时间和抑制剂的关系。研究发现，头花蓼提取物在0.2～5.0mg/mL内，Caco-2细胞的摄取量与药物浓度呈良好的线性关系，故本实验在研究不同时间、温度、pH、P-gp抑制剂对摄取量的影响时头花蓼提取物的浓度选择中间值2mg/mL；由于在各自相应浓度范围内，Caco-2细胞摄取表现出一级速率过程的特征，表明头花蓼提取物中6种主要成分的摄取机制可能为被动扩散。

本实验结果表明，头花蓼提取物摄取量对时间、浓度、温度均具有一定的依赖性。除槲皮素外其余5种成分的细胞摄取量都随着温度的增加而增加，且37℃环境下更有利于细胞的摄取。这可能与酶的活性有关，随着温度升高，酶活性增强，细胞摄取量逐渐增加。头花蓼提取物中各成分摄取量随着时间的增加而增加，而原儿茶酸随着时间的增加摄取量缓慢降低，提示可能有P-gp参与细胞摄取过程，这一结论在P-gp抑制实验中也得到进一步证实。胃肠道内不同部位的pH环境可以影响药物的某些离子化存在状态，从而影响药物在体内的溶解性能及其胃肠道吸收情况，因此有必要对其所处的pH环境进行考察。实验结果表明，随着pH值的增加，细胞摄取量逐渐降低，说明在酸性条件下有利于没食子酸等6种成分的摄取，而在中性、偏碱性条件下，细胞摄取量明显降低。这可能是由于没食子酸等具有酚羟基结构，显弱酸性，所以在中性、偏碱性条件下水解为盐的形式，从而导致膜的渗透性降低。

本实验采用Caco-2细胞摄取的方法考察没食子酸等6种成分是否是P-gp的底物，由于Caco-2细胞也能表达其他外排载体蛋白，因此一般采用2～3种P-gp抑制剂（如利血平、维拉帕米、环孢素A、酮康唑等）进行研究来判断受试药物是否是P-gp的底物，以增加研究结果的准确性。实验选择经典的P-gp抑制剂维拉帕米及环孢菌素A。环孢菌素A既是P-gp抑制剂，也是MRP2抑制剂。如果药物的外排可被维拉帕米和环孢菌素A同时抑制，即可证明药物的外排与P-gp有关。本实验发现，维拉帕米和环孢菌素A对原儿茶酸的摄取量与对照组比较显著增加（ P ＜0.05），说明原儿茶酸的摄取过程中有P-gp参与，即原儿茶酸是P-gp底物；而没食子酸等5种成分的摄取量与对照组比较没有显著增加（ P ＞0.05），说明没食子酸等5种成分的摄取过程中没有P-gp参与，即没食子酸、杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素不是P-gp底物。

Caco-2模型是应用最广泛的体外吸收模型。目前国内外已经有人将Caco-2细胞模型用于天然药物的研究，研究热点集中在黄酮类、生物碱类和皂苷类物质，而这些研究大多是对单一的中药化学成分的研究。由于中药成分复杂，无论是单味药还是复方药，均含有多种化学成分，因此仅通过研究单一成分的吸收特征来说明中药的吸收机制具有很大的片面性，容易忽视其他成分的影响。如何将Caco-2细胞模型用于中药多成分吸收机理及筛选的研究，值得进一步探索。

二、头花蓼提取物离体外翻肠囊模型的吸收特性研究

外翻肠囊模型是由Wilson和Wiseman于1954年创建，最早用于研究葡萄糖和氨基酸在肠道的代谢与转运，后经改进目前成为最常用的体外肠道吸收生物模型，这是一种能够快速反映药物吸收行为的体外方法。鉴于目前头花蓼的药效物质不明确，故本实验采用简便、快速、重复性良好的大鼠肠囊外翻模型，同时应用UPLC-MS/MS法考察头花蓼提取物中没食子酸、原儿茶酸、杨梅苷、陆地棉苷及槲皮苷5种主要成分在小肠中的吸收特性，为头花蓼的药效物质实验提供参考。

（一）供试药液制备

称取头花蓼提取物适量溶解于Tyrode液中，10000rpm离心5min，配制成低、中、高浓度（18.73、37.45、74.90mg/mL）的头花蓼提取物肠吸收液。

（二）外翻肠囊实验

将制备的肠管放入盛有10mL37℃恒温Tyrode液的麦氏浴管中，开始供混合气体（95% O 2 、5% CO 2 ）。在肠管中注入2mL Tyrode液平衡10min。将Tyrode液换成低、中、高3个浓度的含药Tyrode液，分别在15、20、45、60、90、120min取样200µL，同时补充等体积的37℃Tyrode液。样品放入Eppendorf管中，-20℃保存。实验后将各肠管纵向剖开，自然摊于滤纸上测量其长度和宽度，记录吸收面积A。取肠外翻样品溶液100µL，加入20µg/mL内标溶液10µL、15%乙腈300µL及1%的甲酸50µL，涡混1min，15000rpm离心5min，取上清液进样UPLC-MS分析。

（三）不同肠段中5种成分的单位肠管面积累积吸收量（ Q ）比较

在120min时，空肠对没食子酸、原儿茶酸及槲皮苷的累积吸收量最高，其次为回肠、十二指肠与结肠。5种成分中没食子酸、原儿茶酸与槲皮苷的累积吸收量较大，杨梅苷累积吸收量最小。5种成分在各肠道的吸收趋势为空肠=回肠＞ 十二指肠＞结肠。

（四）不同浓度头花蓼提取物中5种成分在不同肠段中的 K a 比较

对不同浓度头花蓼提取物中5种成分在不同肠段中的吸收速率常数（ K a ）进行统计学分析，结果见表2-3、表2-4。对头花蓼提取物不同浓度时没食子酸等5种成分的 K a 进行方差分析比较，结果显示在各肠段中没食子酸等5种成分的 K a 随着头花蓼提取物浓度的增加而增加（ P ＜0.05），表明没食子酸、原儿茶酸、杨梅苷、陆地棉苷及槲皮苷的吸收可能为被动吸收。

（五）讨论

实验结果显示，没食子酸、原儿茶酸、槲皮苷、陆地棉苷及杨梅苷在小肠均有吸收，5种成分在各肠道的吸收趋势为空肠、回肠＞十二指肠＞结肠。5种成分在相同肠段中的吸收差异较大，且同一种成分在不同部位和在相同部位不同浓度的吸收也存在差异，说明小肠对中药成分吸收具有选择性，并不是简单的半透膜被动吸收过程。通过对5种成分的 K a 及 Q 进行比较，发现其均具有浓度依赖，即5个化合物的 K a 均随着头花蓼提取物药液浓度的增加而增加（ P ＜0.05），符合被动吸收规律。但是通过统计发现，5种成分的浓度依赖却有强有弱，因此推测其中有的成分除了被动扩散外还有其他的转运方式，有待下一步实验证实。

三、头花蓼提取物在体循环灌流肠吸收的动力学研究

本部分实验将在Caco-2细胞摄取模型的基础上采用大鼠循环灌流模型，从在体的角度探讨头花蓼提取物中透过细胞的可被吸收成分在大鼠小肠的吸收程度，考察头花蓼提取物中没食子酸、原儿茶酸、杨梅苷、金丝桃苷及槲皮苷5种成分在小肠中的吸收特性，以及不同因素（不同浓度药物、P-gp抑制剂、胆汁、肠段）对头花蓼提取物中5种成分在小肠吸收的影响，以期获得头花蓼提取物中主要成分在肠道的吸收机制、影响因素、有无特定吸收部位等信息。

（一）供试液的制备

取适量头花蓼提取物，加入适量的K-R营养液，超声10min，5000rpm离心10min，取上清液备用，获得1.5、3.0、6.0mg/mL的供试液。

（二）样品处理方法

取样品100µL，置于1.5mL塑料离心管中，加入20µg/mL内标溶液20µL、1%的甲酸水溶液100µL，加入400µL甲醇，涡混1min，15000rpm离心5min，取上清液于UPLC-MS/MS进样分析。

（三）大鼠在体循环灌流实验

实验前大鼠禁食过夜（自由饮水），大鼠腹腔注射25%乌拉坦1.4g/kg，麻醉后固定。沿腹中线打开腹腔（3～4cm），于实验肠段两端各切一小口，在上端小口处插入直径为0.3cm的硅胶管，并用线扎紧。用注射器将37℃的生理盐水缓缓注入肠管，洗去肠管内容物至净。然后在实验肠管下端小口处插入硅胶管，并用线扎紧。肠管两端的硅胶管与蠕动泵的胶管连接，形成回路，开动蠕动泵。取50mL肠循环液以5mL/min流速循环15min后，将流速调节为2.5mL/min，立即自循环液瓶中取样1mL作为测定零时间药物浓度的样品，另向量筒中补加K-R缓冲液1mL。其后每隔30min按同法取样并补加K-R缓冲液，循环3h后中止。在循环回路中用50mL量筒盛装含药肠循环液，每到取样时间点读取液体体积。待循环完毕，用空气排净肠内和管路内液体，即为肠道和管路的死体积。死体积加上每一时间点的量筒读数即为该时间点循环液体积。以此方法进行肠循环液的体积校正。以剩余药量的自然对数ln（ X ）对取样时间 t 作图，求出吸收转化速率常数 K a （h -1 ），3h百分吸收转化率 A （%）等参数。十二指肠段自幽门1cm处开始往下10cm止；空肠段自幽门15cm起往下10cm止；回肠段自盲肠上行20cm开始往上10cm止；结肠段从盲肠下端开始往下10cm止。全肠段考察自十二指肠上端起至回肠下端止。

（四）数据分析

1.头花蓼提取物在体肠吸收肠剩余药量的计算

该式中 ，即循环液药物初始浓度； ，即循环液初始体积； ，即 t n 时刻循环液药物浓度； ，即 t n 时刻循环液体积； t n ，即循环液灌注时间； ，即循环液初始药物量； ，即 t n 时刻循环液药物量。

2.吸收动力学参数的计算 以小肠内剩余药量的对数ln（ X ）对取样时间 t 作图，由直线斜率计算吸收转化速率常数 K a 。

（五）头花蓼提取物的肠道吸收特性研究

1.头花蓼提取物的浓度对吸收的影响 取禁食后大鼠随机分组，每组4只，分别考察质量浓度为1.5、3.0、6.0mg/L（pH=6.0）的头花蓼提取物中没食子酸等5种成分的 K a 和3h累积吸收转化率，结果见表2-5。

通过比较3h累积吸收转化率，显示没食子酸、杨梅苷和槲皮苷在中浓度时 A 要明显高于高浓度，统计学有显著性差异；原儿茶酸在低、中浓度时 A 要明显高于高浓度，统计学有显著性差异；金丝桃苷在低浓度时 A 要明显低于中、高浓度，统计学有显著性差异，说明没食子酸、原儿茶酸、杨梅苷、槲皮苷在高浓度下可能存在饱和现象，提示其在体内的吸收机制不仅是单纯的被动吸收过程，可能存在主动转运和易化扩散。

在三个浓度下以肠内剩余药量的对数ln（ X ）对取样时间 t 做线性回归，所得直线的 r 均大于0.9，符合一级动力学过程，结果见图2-12。

2.胆汁对头花蓼提取物吸收的影响 取4只大鼠，按“（三）大鼠在体循环灌流实验”项下方法操作，结扎大鼠胆管。选择pH为6.0的头花蓼提取物溶液（3.0mg/L）50mL作为肠灌流液，进行整肠段循环实验。考察胆汁对头花蓼提取物肠道吸收的影响，结果见表2-6。

通过比较3h累积吸收转化率，经方差分析结果表明，胆汁对原儿茶酸、杨梅苷、金丝桃苷在小肠内的吸收具有显著影响，其中胆汁对原儿茶酸的吸收具有抑制作用，而对杨梅苷和金丝桃苷的吸收具有促进作用。

3.P-gp抑制剂对头花蓼提取物吸收的影响 取禁食后的大鼠，随机分组，每组4只。选择pH为6.0的头花蓼提取物溶液（3.0mg/L）50mL作为肠灌流液。考察维拉帕米抑制P-gp条件下提取物溶液中没食子酸等5种成分在小肠的吸收情况，验证其吸收是否受到P-gp外排泵作用的影响，结果见表2-6。

通过比较3h累积吸收转化率，经方差分析结果表明，加入P-gp抑制剂后原儿茶酸的吸收增加，具有显著性差异；而没食子酸、杨梅苷、金丝桃苷和槲皮苷在小肠内的吸收略有降低，但不具有显著性差异。说明头花蓼提取物中的原儿茶酸受到P-gp外排泵的影响，提示该成分可能是药物转运蛋白P-gp的底物。

4.头花蓼提取物在不同肠段的吸收特点 取禁食后的大鼠，随机分组，每组4只。对大鼠各肠段进行结扎，包括十二指肠段（自幽门1cm处起往下10cm处）、空肠段（自幽门15cm处起往下10cm处）、回肠段（自盲肠上行20cm处开始往下10cm处）、结肠段（从盲肠后端开始往下取10cm处）。选择pH为6.0的头花蓼提取物溶液（3.0mg/L）50mL作为肠灌流液。不同肠段分别用供试液进行回流，考察大鼠肠道各区段的吸收情况，结果见表2-7、表2-8。

比较不同肠段各成分的3h累积吸收转化率，结果显示没食子酸在十二指肠、空肠、回肠的吸收较结肠快，同时空肠的吸收较回肠快，统计学有显著性差异；原儿茶酸、杨梅苷和金丝桃苷在十二指肠、空肠、回肠的吸收较结肠快，同时十二指肠的吸收较回肠快，统计学有显著性差异；槲皮苷在回肠的吸收较十二指肠快，同时十二指肠的吸收较结肠快，统计学有显著性差异。

各成分在不同肠段的吸收趋势：①没食子酸：空肠＞十二指肠＞回肠＞结肠；②原儿茶酸：十二指肠＞空肠＞回肠＞结肠；③杨梅苷：十二指肠＞空肠＞回肠＞结肠；④金丝桃苷：十二指肠＞空肠＞回肠＞结肠；⑤槲皮苷：回肠＞空肠＞十二指肠＞结肠。

（六）讨论

药物吸收、分布、代谢和排泄研究是新药开发和评价的重要环节之一，而吸收是其中的首要环节，也是影响药效的关键。研究药物的肠道吸收，了解药物在肠道的吸收行为，有利于剂型的选择和辅料的筛选，从而可以提高药物的生物利用度，指导临床用药。除了Caco-2细胞模型外，大鼠在体灌流模型也被广泛应用，此模型不切断血管及神经，既可保持胃肠道神经和内分泌输入的完好无损及胃肠道内容物中酶的活性，又能保证血液及淋巴液供应不变，因而其生物活性有所提高，其测得的吸收速率等指标亦与体内法相近，且能消除胃肠内容物的排出和消化管固有运动性等生理因素的影响。

Caco-2细胞摄取实验确定了没食子酸等6种可被摄取成分。本部分欲运用在体肠灌流实验进一步考察没食子酸等6种可被吸收成分在小肠的表观吸收情况。而在稳定性考察时发现，槲皮素在循环液中不稳定，在K-R液中37℃水浴3h降解明显，原因可能是其在体外环境中极不稳定，见光易分解、氧化所致，因此在后期实验中未对槲皮素进行测定。

不同环境下药物的解离程度不同，而药物解离度是影响药物吸收及生物利用度的因素。头花蓼提取物中的酚酸类成分没食子酸和原儿茶酸，黄酮类成分杨梅苷、金丝桃苷及槲皮苷均为弱酸性药物，在酸性环境下解离少、分子型药物多、吸收多。实验结果中5种主要成分在酸性环境的十二指肠、空肠中吸收较好。其在酸性条件下吸收较好与前期Caco-2细胞摄取实验结果相符合。

由于大鼠没有胆囊，其分泌的胆汁直接进入十二指肠。胆汁的主要成分胆汁酸能够改善药物的溶解性能，且大多数药物及其代谢产物主要是通过胆汁排泄，因此有必要考察胆汁对各药物成分在小肠吸收的影响。实验结果表明，胆汁对原儿茶酸的吸收具有抑制作用，对杨梅苷和金丝桃苷的吸收具有促进作用。为了排除胆汁排泄因素对吸收及测定的影响，后续实验将对大鼠胆总管进行结扎。

药物在肠黏膜细胞的转运机制主要包括被动扩散、主动转运、促进扩散及胞饮作用。除被动扩散外，其他三种转运过程均存在饱和现象。研究结果显示，没食子酸、杨梅苷和槲皮苷在中浓度时 A 及 K a 要明显高于高浓度；原儿茶酸在低、中浓度时 A 及 K a 也明显高于高浓度（ P ＜0.05）。其原因可能是这几种成分在中至高浓度时已经达到饱和，提示其在体内的吸收机制不仅是单纯的被动吸收过程，可能存在主动转运和易化扩散。这一结果和细胞摄取结果有所不同，可能是因为肠灌流实验只设计了3个浓度梯度的原因，亦可能是两种模型肠道的活性存在差异性（体外、在体），其诱使肠道酶的活性亦存在差异。因此，以多生物模型、多角度研究中药有效成分的吸收机理、吸收影响因素有其必要性。 atC5kAi8r660AXT8mYORBQsCFfE0i2fqM64g/C7ivg6qt9+H7fY7HFS/NraScTIe