五、DNA序列测定方法

自从1953年Watson和Crick构建了DNA双螺旋模型后，人们开始探索DNA分子的一级结构。DNA序列测定逐渐成为分子生物学研究的一项重要技术。DNA测序技术始于20世纪70年代中期，随着40多年的发展，DNA序列测定经历了从手工到自动，从慢速到快速的发展阶段，目前已经发展到了第三代，并且还在不断出现新的技术方法。第二代和第三代测序技术，又称为高通量测序技术。

1.第一代测序技术 传统的双脱氧链终止法、化学降解法以及在它们的基础上发展起来的各种DNA序列测定统称为第一代DNA测序技术，尤以双脱氧链终止法最具代表性。双脱氧链终止法又称Sanger法，是1977年由英国生物化学家Sanger发明的，它的原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种单脱氧核苷三磷酸存在条件下复制，在4管反应体系中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸，因为双脱氧核苷没有3′-OH，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3′端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4条泳道进行凝胶电泳，分离得到长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差1个碱基。经过放射自显影后，根据片段3′端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。Sanger法操作简便、应用广泛，在此法基础上发展出了荧光自动测序技术，实现了DNA测序的自动化。第一代测序准确性高，通量低，一般用于较短DNA片段的测序，是DNA体外重组技术和分子鉴定研究的必要前提。

2.第二代测序技术 随着2001年人类基因组测序的完成，生命科学进入功能基因组时代。一代DNA序列测定方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，因此一些测序平台应运而生，如GS FLX、SOLiD、Solexa Genome Analyzer等。第二代测序技术最显著的特征是高通量，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列分析。这种测序技术是将片段化的基因组DNA两侧连上接头，以产生数百万个空间固定的PCR克隆阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成，然后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行，每个延伸反应所掺入的荧光标记成像检测也可同时进行，从而获得测序数据，并通过计算机分析就可以获得完整的DNA序列信息。第二代测序技术已广泛应用于生物转录组及基因表达谱分析、基因调控、SNP分析、小RNA等研究领域，且成本较低。

3.第三代测序技术 从2008年开始，以单分子测序为代表的第三代DNA测序技术逐渐出现，其不需要经过PCR扩增，可实现对每一条DNA分子单独进行序列分析。目前第三代测序技术按照原理不同，可分为单分子荧光测序和纳米孔测序两类。具有测序速度快、精度高的优点，可以进行大片段DNA、RNA、甲基化DNA序列测定，尤其在DNA甲基化和突变鉴定研究方面发挥重要作用。 3yiPLRDfwbvAPndNBHC0vnYkBcyMaUsadRz53vg3jUpmCKFeUs1gW9hObe/jEwSb