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DNA体外重组（ in vitro DNA recombination）是指利用限制性内切酶切割DNA以获得目的DNA片段，然后用连接酶将目的DNA片段与合适的载体连接，形成重组DNA的过程（图2-7）。然后导入宿体细胞内，使这个基因能在宿体细胞内复制、转录、翻译表达。宿主细胞（host cell）是DNA体外重组的受体细胞，可以是原核细胞也可以是真核细胞。DNA体外重组技术是合成生物学的重要组成部分，通过改造的宿主细胞有望以异源生产中药活性成分。
图2-7 DNA体外重组和表达过程
要把外源基因通过基因工程技术导入生物细胞中，需要一个合适的载体（vector）。借助这个载体，外源基因可以进入受体细胞中复制和表达。
载体的种类较多，以原核细胞为宿主的载体主要有质粒载体和噬菌体载体，以真核细胞为宿主的载体主要为病毒载体，以及由它们改造衍生而来的各种用途的载体。根据功能可分为克隆载体和表达载体，前者的目的是获得大量的DNA片段，后者是为了获得DNA片段所编码的蛋白质。绝大多数载体都是DNA，具备以下共同特点：具有独立的复制子（能独立进行复制，包括复制起点的单位），在宿主细胞中能够独立地自我复制，即使与外源DNA片段共价连接时也不影响其复制；容易从宿主细胞中分离纯化；载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，当外源DNA片段插入其中时能使其与载体一起复制和扩增。
1.质粒 质粒（plasmid）是指细菌细胞质中独立于细菌染色体之外能自主进行复制的遗传单位。它是双链环状DNA分子，长度从1kb至200kb不等。由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、产生大肠埃希菌素、限制酶和修饰酶等，如根瘤农杆菌的Ti质粒还能诱导植物肿瘤。在基因工程中常利用质粒表达产物对氨苄青霉素（ampicillin）、氯霉素（chloramphenicol）、卡那霉素（kanamycin）等具有抗性的基因作为选择标记。
一种质粒在一个细胞内所含有的数目称为质粒的拷贝数（copy number）。质粒在细菌中的复制有两种类型，分别为严谨型质粒（stringent plasmid）和松弛型质粒（relaxed plasmid）。细胞染色体复制一次，严谨型质粒也复制一次，每个细胞内，只有1～2个拷贝，松弛型质粒则在染色体停止复制后，仍然能继续复制，每个细胞内一般有10～200个拷贝，故基因工程中使用的质粒均属于这种类型。
质粒载体的命名采用p+英文大写字母+数字的形式，p代表质粒（plasmid），英文大写字母代表发现者或实验室，数字代表质粒的编号。如pBR322名称中，B为构建者F.Bolivai姓名的缩写，R为构建者R.L.Rodriguez姓名的缩写，322为质粒编号。
两种不同质粒在同一细胞内能够稳定地共存，两者的复制控制互不干扰，这种现象称为质粒相容性（plasmid compatibility），反之称为质粒不相容性（plasmid incompatibility）。一般在没有选择压力的情况下，两种不同的质粒不能共存于同一宿主细胞内，有一种会完全丧失，原则上两种质粒的机会是相等的。DNA体外重组技术正是基于质粒的不相容性，在只带有一种质粒的细菌中，提取到单一的质粒DNA作为载体进行DNA重组。
一种理想的质粒载体应当具备以下条件：①分子相对较小。这可使限制性内切酶在质粒上的酶切位点减少。②拷贝数较多。这可导致克隆的外源基因量增加，一般会选择松弛型质粒。③在复制子以外的适当位点，构建几个限制性内切酶的单一酶切位点，且最好位于易于检测的表型性状相关基因上。④赋予宿主细胞易于检测的表型。目前常用两种方法，一种是在质粒中构建1～2个抗生素抗性基因，以便为寄主细胞提供易于检测的表型性状；另一种是利用外源DNA插入质粒后，转化大肠埃希菌后形成的菌落颜色产生变化，如在许多质粒载体中构建半乳糖苷酶的蓝/白斑筛选系统。近年来，根据DNA体外重组实验的不同需求，研究人员已经人工构建了pBR322、pUC、pSP64/65、pGEM-3等不同类型的质粒载体。
2.λ噬菌体 λ噬菌体（phage）为线状双链DNA细菌病毒，长度为48502bp，在形态上λ噬菌体由头与尾两部分组成，整个基因组DNA位于头部。λ噬菌体基因组分为左臂、右臂和中央区3个组成部分，生物学功能上相关的基因聚集在一起，如编码头部和尾部蛋白质的各种基因定位在左臂区；负责DNA复制、使宿主细胞裂解及调控序列位于右臂区；中央区包含的基因对形成噬菌体并不必需，可以被外源DNA取代而不影响噬菌体的形成，这一特性是λ噬菌体可以作为载体的基础。
在λ噬菌体DNA分子的两端各有12个碱基的单链互补黏性末端称为cos位点（cohesive end site）。一旦噬菌体入侵进入宿主细胞后，λ噬菌体DNA两端cos位点便融合起来，使DNA分子变成环状。
在感染宿主细胞的早期，λ噬菌体DNA以这种环状形式进行转录，此后进入裂解生长途径（lytic）和溶源性生长途径（lysogenic）。在裂解生长途径中，环状DNA大量复制，各种噬菌体产物不断形成，在此基础上形成子代噬菌体并日趋成熟，最终导致细胞裂解，并释放出大量新生的感染性病毒颗粒。例如，λ噬菌体感染大肠埃希菌时，首先由噬菌体尾部吸附于宿主细胞表面，接着λ噬菌体DNA注入细胞内，双链线性DNA分子自行环化并进行复制。在DNA复制的同时，基因组在受控制条件下开始转录和表达，产生构成噬菌体颗粒所需的结构蛋白。噬菌体颗粒的组装包括头部结构的组装和尾部的形成。溶源性生长途径是指感染后的噬菌体颗粒整合到宿主DNA中，随后同染色体基因一起复制并转移到子代细菌中。染色体DNA上整合有噬菌体基因组的宿主细胞，并不会由于噬菌体的感染而发生裂解，这种现象称为溶源现象（lysogenesis）。整合有噬菌体的宿主细胞称为溶源菌，被整合的噬菌体称为前噬菌体（prophage）。
由于野生型λ噬菌体存在一些缺陷，并不能作为载体，需要根据实验目的进行人工改造，如消除或改变λ基因不必要的限制性内切酶位点，在可替代区构建所需的内切酶位点，插入外源启动子以提高载体效率等。λ噬菌体作为DNA重组载体主要用于构建基因组DNA文库和cDNA文库等。根据DNA重组的需要，目前已人工构建了很多λ噬菌体衍生的载体，如Charon系列取代性载体、EMBL系列取代性载体。
1.外源DNA与载体连接 限制性内切酶被喻为基因工程的“手术刀”，通常使用同一限制性内切酶切割外源DNA和载体，根据外源DNA与载体切割部位是否存在突出碱基，可分为平末端和黏末端，接着将切割后的外源DNA与载体连接起来，黏末端连接比平末端连接更为容易。然而，当面对多个片段克隆、缺乏合适的限制性内切酶以及长距离PCR操作等情况时，利用DNA同源重组技术来连接外源DNA和载体更为省时省力。在进行重组时，需要设计一段同源臂，从而使重组达到很高的效率和正确率，目前该技术在DNA体外重组中已被广泛应用。
2.外源DNA导入宿主细胞 外源DNA转入宿主细胞并获得新表型的过程称为转化（transformation）；由噬菌体和细胞病毒介导的转化称为转导（transduction）。相对于原核细胞，真核细胞导入外源DNA片段获得新表型的过程称为转染（transfection）。
一般情况下，未经处理的宿主细胞对重组DNA分子是不敏感的，只有采用物理、化学等方法处理宿主细胞后，使细胞膜通透性上调，容易接纳外源DNA，才能完成转化或转染过程。这种处于敏感状态的宿主细胞称为感受态细胞（competent cell）。
3.重组体导入的宿主细胞筛选和鉴定 当重组DNA分子导入感受态宿主细胞后，必须知道哪些感受态细胞已转化为重组DNA分子，即从许多转化菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，在初步筛选的基础上进一步鉴定某个菌落确实含有阳性重组子，以便进一步培养、扩增，并获得目的基因的大量拷贝，为后续研究提供基础。目前常用的阳性重组子筛选方法有抗生素平板筛选和 β -半乳糖苷酶系统筛选，常用的鉴定方法有小量制备载体DNA并作限制性内切酶分析、Southern印迹杂交分析和免疫化学检测分析。
4.目的基因表达 目的基因的表达是指重组DNA导入到受体细胞中，进行转录、翻译及后加工等过程，从而产生具有生物活性的基因表达产物。目前，有大量中药活性成分生物合成相关基因在体外进行了表达。目的基因可以在不同的宿主细胞中表达。根据选用的载体系统和受体细胞类型，选择不同的方法将重组DNA导入受体细胞进行表达。根据受体细胞类型的不同，表达系统包括原核表达系统和真核表达系统。
（1）外源基因的原核表达 在各种表达系统中，原核表达系统是最早采用的，也是目前最为成熟的表达系统。原核表达系统具有遗传背景清楚、成本低、周期短、效率高、易操作等优点，是外源基因首选表达系统。但由于原核细胞中没有真核生物的蛋白质翻译后加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化及正确折叠，因此通过原核表达得到具有生物活性的蛋白概率较低，常常需要表达后进行蛋白质复性。常见的原核受体菌主要有大肠埃希菌 Escherichia coli 、枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 、棒状细菌 Corynebacterium 和蓝细菌 Cyanobacterium 等。
①大肠埃希菌表达系统：在众多目的基因表达系统中，大肠埃希菌表达系统是目前研究最为深入、发展最迅速的原核表达系统，具有遗传背景清晰、生长繁殖快、培养简单、成本低、表达量高等优点，是基因工程中最为常用的表达系统。但是，大肠埃希菌表达系统也存在一些不足，如目的蛋白质常以包涵体形式表达，产物纯化困难，表达产物的生物活性较低。
②枯草芽孢杆菌表达系统：枯草芽孢杆菌是革兰阳性菌的典型代表，广泛存在于土壤、湖泊、海洋、动植物的体表，不具有致病性，单层细胞外膜，能直接将多数蛋白分泌到培养基中，如分泌细菌素（枯草菌素、多黏菌素、制霉菌素等）、脂肽类化合物、有机酸类物质等。枯草芽孢杆菌是一个很好的分泌型表达系统，重组蛋白质通常以可溶的活性形式高产量地分泌到培养基中，但是表达量较低。随着生物技术和基因工程的发展，枯草芽孢杆菌基因工程表达系统快速发展，并表现出良好的应用前景。
（2）外源基因的真核表达 真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系，表达的外源蛋白更接近天然蛋白质。因此，真核表达系统比原核表达系统更有优势。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统包括酵母、昆虫和植物细胞等。
①酵母表达系统：酵母菌是一类低等真核生物，既具有类似原核生物的生长特性，生长快速、成本低，又具有真核生物的特性，即具有细胞的翻译后修饰过程，特别适用于大量生产真核重组蛋白，是应用最为普遍的真核表达系统之一。酵母表达系统的优点主要在于：a.酵母长期广泛应用于酿酒和食品工业，不会产生毒素，安全、可靠；b.酵母是真核生物，能进行一些表达产物的后期加工，有利于保持生物的活性和稳定性；c.外源基因在酵母中能分泌表达，表达产物分泌至胞外不仅有利于纯化，且避免了产物在胞内大量蓄积，而对细胞产生不利影响；d.遗传背景清楚，容易进行遗传操作；e.较为完善的表达控制系统；f.生长繁殖迅速，培养周期短，工艺简单，生产成本低。目前使用的酵母表达系统有酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等。
②昆虫细胞表达系统：该系统是一类应用广泛的真核表达系统，其优点在于：a.具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰、加工及转移外源蛋白的能力，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构功能上更接近天然蛋白；b.由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达，其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；c.可表达非常大的外源性基因（达200kDa）；d.具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力；e.安全性高。但是该系统成本很高，且需特殊的培养基和培养设备，分离纯化步骤较为繁杂，同时受生物量小、培养周期长等因素的制约，难以进行大规模生产。
③植物表达系统：植物表达系统主要包括细胞悬浮培养、毛状根培养体系转基因植株等。根据目的蛋白表达的时空差异，可将哺乳动物细胞表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。诱导表达系统是指受激素、重金属离子等小分子诱导后目的基因开始转录。植物细胞转化最常见的方式是根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens 介导外源基因导入植物细胞，从而使转基因植株获得稳定表达的外源基因以及对应性状。随着分子植物病毒学的发展，植物病毒介导的表达载体也应用于植物转化。该系统的优点在于：a.有利于重组蛋白的正确装配和表达，如糖蛋白类活性药物、抗体、抗原、细胞因子等，其表达产物具有与天然结构一致或接近的生物学活性和免疫原性；b.可进行组织或生长阶段特异性诱导表达；c.利用分泌性信号序列将外源蛋白产物分泌出植物体；d.可利用转基因植物进行杂交育种，实现多价转基因植物疫苗的生产；e.廉价、安全、成本低、易于存储和运输。目前在转基因烟草中生产植酸酶，其含量已达到可溶性蛋白的14%；建立的植物油体表达体系，已成功地表达了水蛭素、木聚糖酶、 β -葡糖醛酸苷酶等蛋白。其缺点在于外源蛋白在植物中的表达量较低、免疫原性较差，可通过选择合适的表达系统、载体优化、使用免疫佐剂等方法突破这些障碍。