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三、聚合酶链式反应

(一)PCR的基本原理

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是美国的Kary Mullis于1985年发明的一项具有划时代意义的技术。这项技术可在试管内仅用几个小时将特定的DNA片段扩增数百万倍。PCR技术是DNA分析最常用的技术之一,其在DNA重组、基因结构分析、基因表达分析及基因功能检测等方面具有重要的应用价值。PCR技术极大地推动了生命科学研究的进步,其发明人Mullis也因此在1993年获得诺贝尔化学奖。

PCR技术模拟了DNA的复制过程(图2-3),其特异性主要体现在与靶序列两端互补的寡核苷酸引物上。PCR的整个反应由变性、退火和延伸三个基本步骤组成。

1.变性(denaturation) 将待扩增的模板DNA加热至94℃,DNA双链解离,成为单链DNA。

2.退火(annealing) 模板DNA变性完全后将温度降至55℃左右(可根据实际情况进行增减),这时引物与变性的模板DNA单链按照碱基互补配对的方式结合。

3.延伸(extension) 将反应体系温度升高至72℃左右,模板DNA与引物的结合物在DNA聚合酶(如 Taq DNA聚合酶)的作用下,以dNTP为底物,按碱基互补配对和半保留复制的原则合成一条新的DNA链。

以上三个基本步骤为一次循环,重复循环便可以获得更多的“半保留复制链”,这种新链将成为下次循环的模板。30~40个循环后,靶序列就能被扩增放大几百万倍。

图2-3 PCR原理示意图

(二)PCR技术操作方法

1.配制反应体系。在反应管中依次加入下列溶液:ddH 2 O、10×buffer、dNTP、MgCl 2 、引物1和引物2、模板DNA、DNA聚合酶(如 Taq DNA聚合酶)。

2.将样品放入反应室内,设置PCR的反应程序。

3.启动反应程序。

4.扩增产物的电泳检测。见图2-4。

图2-4 PCR技术操作方法示意图

(三)影响PCR的主要因素

PCR体系主要由引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、Mg 2+ 、反应缓冲液组成。

1.引物 决定PCR产物特异性的关键是引物的设计。设计引物应遵循以下原则:

(1)长度为15~30bp,常为20bp左右。

(2)最适宜的扩增长度是200~500bp。

(3)其中G+C含量以40%~60%为宜,过高则扩增效果不佳,过低则易产生非特异性产物。4种碱基最好随机分布,避免5个以上连续排列的嘌呤或嘧啶核苷酸。

(4)避免引物内部出现二级结构及两条引物互补的现象。

(5)引物3′端的碱基,尤其最末及倒数第二个碱基,需要严格与模板配对,以免由于末端碱基配对不成功导致PCR失败或非特异性扩增。

(6)引物序列必须与该物种其他DNA序列无明显的同源性。

(7)PCR中,每条引物的浓度为0.1~1μmol/L,即保证进行特异性扩增的最低引物量,引物浓度偏高容易导致错配及非特异性扩增。

2.DNA聚合酶 DNA聚合酶能够以单链DNA为模板,沿5′→3′方向将dNTP按照碱基互补配对原则加到引物的3′端,合成新链。当反应体系中酶的量过高,容易引起非特异性扩增,而浓度过低则合成的产物量达不到预期的值。 Taq DNA聚合酶是PCR中普遍使用的一种酶,但该酶没有校正功能, Pfu DNA聚合酶或经结构改造的 Taq DNA聚合酶可提高扩增特异性。

3.dNTP dNTP的浓度和PCR扩增效率有密切关系。由于多次冻融会使dNTP降解,故需要小量分装后于-20℃保存。在PCR中,dNTP的终浓度一般在20~200μmol/L,浓度过高或是4种dNTP的浓度不等时容易引发错配,浓度过低会降低PCR产物的产量,甚至影响 Taq DNA聚合酶的活性。dNTP可与Mg 2+ 结合,降低游离Mg 2+ 的浓度,所以要注意两者的平衡。

4.模板DNA PCR对模板DNA的纯度要求不是很高,但是不能有影响扩增反应的物质存在,如乙醇等,否则会影响扩增效果。一般情况下50μL的反应体系中加入50ng的模板DNA即可,模板量过多反而会导致非特异性扩增或因杂质过多抑制PCR。

5.Mg 2+ 在一般的PCR中,各种dNTP浓度为200μmol/L时,Mg 2+ 浓度一般为1.5~2.0mmol/L。Mg 2+ 浓度过高,容易出现非特异性扩增,浓度过低会使 Taq DNA聚合酶的活性降低,从而使反应产物减少。许多 Taq DNA聚合酶生产商通常将合适浓度的Mg 2+ 加入反应缓冲液中。

6.温度参数

(1)变性 变性温度低引发解链不完全,将导致PCR失败。一般情况下,93~95℃,30~60秒足以使模板DNA变性。由于高温对DNA聚合酶的活性有影响,所以变性温度不能过高。

(2)退火 退火温度与时间要根据引物的 T m 值(与长度和碱基组成等有关)设定,通常为50~72℃,30~60秒。长度为20个核苷酸左右的引物的 T m =(G+C)×4℃+(A+T)× 2℃,退火温度= T m -(5~10℃)。在允许的范围内,选择较高的退火温度能够提高PCR的特异性。

(3)延伸 PCR的延伸温度由 Taq DNA聚合酶的最适催化温度决定,一般设定在72℃,温度过高不利于引物和模板的结合,过低则降低 Taq DNA聚合酶的活性。延伸时间要根据待扩增片段的长度来设定,1kb以内的DNA片段延伸时间为1分钟;1kb以上的片段需要延长时间,但时间过长也会导致非特异性扩增产物的出现。

7.循环次数 PCR循环次数的设定要依据模板DNA的浓度和靶序列的丰度(以cDNA为模板DNA时),一般设定20~40次。循环次数越多,非特异性产物会随之增多,在满足获取足量PCR产物的情况下,尽量减少循环次数。

(四)PCR技术的种类

1.反转录PCR 反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)又称为逆转录PCR。由反转录和PCR两部分组成。第一步,利用随机引物或针对mRNA的poly(A)尾的oligo(dT) n 引物在反转录酶的作用下,将RNA反转录为cDNA第一链。第二步,以cDNA第一链为模板DNA进行PCR扩增。RT-PCR广泛应用于目的基因克隆、探针制备、基因转录水平检测、RNA病毒检测等方面。

2.巢式PCR 巢式PCR(nested PCR)是一种提高靶序列扩增灵敏性和特异性的PCR方法,特别适合一次PCR难以获得所需要量的微量靶序列扩增,且可极大地提高扩增反应的特异性。该方法使用两对PCR引物扩增靶序列,首先用外侧序列设计的引物扩增包含靶序列在内的长DNA片段,然后使用第二对内侧引物进行扩增,内侧引物可结合在第一次PCR产物的内部,故将两对引物称为巢式引物。第二次PCR扩增产物片段长度小于第一次扩增产物。

3.实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)是一种可实时检测PCR进程、高灵敏度的核酸定量技术。因其定量准确、简单高效、特异灵敏的特点,已得到广泛的应用。根据扩增信号的检测方式,分为荧光探针法和荧光染料法两种。荧光探针是一段与被扩增基因互补的寡核苷酸序列,在其两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时,淬灭基团会吸收报告基团发射的荧光信号;但PCR扩增时,DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性会将探针酶切并降解,使荧光报告基团与荧光淬灭基团分开,这时荧光监测系统能够接收到报告基团发出的荧光信号。每一条DNA新链形成,都会释放出一个荧光报告基团,因此荧光信号与PCR产物形成在数量上呈正相关(图2-5)。

荧光染料法是在PCR体系中加入SYBR GreenⅠ染料,这种染料能够与双链DNA结合。随着模板DNA的扩增,新的双链DNA也增多,与双链DNA结合的SYBR GreenⅠ染料也越来越多,使得仪器检测到的荧光信号逐渐增强,从而达到定量检测的目的(图2-6)。

图2-5 实时荧光定量探针法原理示意图

图2-6 实时荧光定量SYBR Green I染料法原理示意图

4.不对称PCR 不对称PCR(asymmetric PCR)的关键点在于上下游引物的浓度比例相差较大,常为50∶1~100∶1。最初10~15个PCR循环的主要产物仍然为双链DNA,但当低浓度引物耗尽后,只由一条高浓度引物介导的PCR会产生大量的单链DNA。不对称PCR可用于制备探针,进行序列分析或核酸杂交。

5.多重PCR 多重PCR(multiplex PCR)指在同一反应中利用多组引物同时对几个不同的DNA片段进行扩增;当其中某一段DNA缺失,则电泳谱上相应的条带就会消失。多重PCR主要用于多个突变位点的检测和基因分型。

6.位点特异性PCR技术 位点特异性PCR技术是一种通过对生物DNA片段进行分析后,用特异性的引物进行PCR扩增,从而达到鉴定目的的一种方法。位点特异性PCR技术由于操作简单、快速的特点,其在中药鉴定方面应用广泛。目前已有研究采用位点特异性PCR技术对蛇、鹿类中药材进行了鉴定,并建立了金银花、何首乌、太子参、酸枣仁的分子鉴定方法。

7.DDRT-PCR技术 DDRT-PCR又称mRNA差异显示技术。该技术是利用mRNA3′端锚定引物进行反转录合成cDNA,然后通过PCR二次扩增,来显示mRNA中差异表达部分的技术。该技术因具有速度快、所需RNA量少和重复性高等优点,已被广泛用于中药研究当中。如研究热和盐胁迫下孔石莼不育突变体生理生化的改变、鉴定龙葵幼苗镉应答的基因等。 ZT+IgIJW/Cyvc4M5SrNYptQg/xr2hJFJTB3aRmSvbweguOIdYb93mqWm/ZMmlL+b

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