三、聚合酶链式反应

（一）PCR的基本原理

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是美国的Kary Mullis于1985年发明的一项具有划时代意义的技术。这项技术可在试管内仅用几个小时将特定的DNA片段扩增数百万倍。PCR技术是DNA分析最常用的技术之一，其在DNA重组、基因结构分析、基因表达分析及基因功能检测等方面具有重要的应用价值。PCR技术极大地推动了生命科学研究的进步，其发明人Mullis也因此在1993年获得诺贝尔化学奖。

PCR技术模拟了DNA的复制过程（图2-3），其特异性主要体现在与靶序列两端互补的寡核苷酸引物上。PCR的整个反应由变性、退火和延伸三个基本步骤组成。

1.变性（denaturation） 将待扩增的模板DNA加热至94℃，DNA双链解离，成为单链DNA。

2.退火（annealing） 模板DNA变性完全后将温度降至55℃左右（可根据实际情况进行增减），这时引物与变性的模板DNA单链按照碱基互补配对的方式结合。

3.延伸（extension） 将反应体系温度升高至72℃左右，模板DNA与引物的结合物在DNA聚合酶（如 Taq DNA聚合酶）的作用下，以dNTP为底物，按碱基互补配对和半保留复制的原则合成一条新的DNA链。

以上三个基本步骤为一次循环，重复循环便可以获得更多的“半保留复制链”，这种新链将成为下次循环的模板。30～40个循环后，靶序列就能被扩增放大几百万倍。

（二）PCR技术操作方法

1.配制反应体系。在反应管中依次加入下列溶液：ddH ₂ O、10×buffer、dNTP、MgCl ₂ 、引物1和引物2、模板DNA、DNA聚合酶（如 Taq DNA聚合酶）。

2.将样品放入反应室内，设置PCR的反应程序。

3.启动反应程序。

4.扩增产物的电泳检测。见图2-4。

（三）影响PCR的主要因素

PCR体系主要由引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、Mg ²⁺ 、反应缓冲液组成。

1.引物 决定PCR产物特异性的关键是引物的设计。设计引物应遵循以下原则：

（1）长度为15～30bp，常为20bp左右。

（2）最适宜的扩增长度是200～500bp。

（3）其中G+C含量以40%～60%为宜，过高则扩增效果不佳，过低则易产生非特异性产物。4种碱基最好随机分布，避免5个以上连续排列的嘌呤或嘧啶核苷酸。

（4）避免引物内部出现二级结构及两条引物互补的现象。

（5）引物3′端的碱基，尤其最末及倒数第二个碱基，需要严格与模板配对，以免由于末端碱基配对不成功导致PCR失败或非特异性扩增。

（6）引物序列必须与该物种其他DNA序列无明显的同源性。

（7）PCR中，每条引物的浓度为0.1～1μmol/L，即保证进行特异性扩增的最低引物量，引物浓度偏高容易导致错配及非特异性扩增。

2.DNA聚合酶 DNA聚合酶能够以单链DNA为模板，沿5′→3′方向将dNTP按照碱基互补配对原则加到引物的3′端，合成新链。当反应体系中酶的量过高，容易引起非特异性扩增，而浓度过低则合成的产物量达不到预期的值。 Taq DNA聚合酶是PCR中普遍使用的一种酶，但该酶没有校正功能， Pfu DNA聚合酶或经结构改造的 Taq DNA聚合酶可提高扩增特异性。

3.dNTP dNTP的浓度和PCR扩增效率有密切关系。由于多次冻融会使dNTP降解，故需要小量分装后于-20℃保存。在PCR中，dNTP的终浓度一般在20～200μmol/L，浓度过高或是4种dNTP的浓度不等时容易引发错配，浓度过低会降低PCR产物的产量，甚至影响 Taq DNA聚合酶的活性。dNTP可与Mg ²⁺ 结合，降低游离Mg ²⁺ 的浓度，所以要注意两者的平衡。

4.模板DNA PCR对模板DNA的纯度要求不是很高，但是不能有影响扩增反应的物质存在，如乙醇等，否则会影响扩增效果。一般情况下50μL的反应体系中加入50ng的模板DNA即可，模板量过多反而会导致非特异性扩增或因杂质过多抑制PCR。

5.Mg ²⁺ 在一般的PCR中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg ²⁺ 浓度一般为1.5～2.0mmol/L。Mg ²⁺ 浓度过高，容易出现非特异性扩增，浓度过低会使 Taq DNA聚合酶的活性降低，从而使反应产物减少。许多 Taq DNA聚合酶生产商通常将合适浓度的Mg ²⁺ 加入反应缓冲液中。

6.温度参数

（1）变性 变性温度低引发解链不完全，将导致PCR失败。一般情况下，93～95℃，30～60秒足以使模板DNA变性。由于高温对DNA聚合酶的活性有影响，所以变性温度不能过高。

（2）退火 退火温度与时间要根据引物的 T _m 值（与长度和碱基组成等有关）设定，通常为50～72℃，30～60秒。长度为20个核苷酸左右的引物的 T _m =（G+C）×4℃+（A+T）× 2℃，退火温度= T _m -（5～10℃）。在允许的范围内，选择较高的退火温度能够提高PCR的特异性。

（3）延伸 PCR的延伸温度由 Taq DNA聚合酶的最适催化温度决定，一般设定在72℃，温度过高不利于引物和模板的结合，过低则降低 Taq DNA聚合酶的活性。延伸时间要根据待扩增片段的长度来设定，1kb以内的DNA片段延伸时间为1分钟；1kb以上的片段需要延长时间，但时间过长也会导致非特异性扩增产物的出现。

7.循环次数 PCR循环次数的设定要依据模板DNA的浓度和靶序列的丰度（以cDNA为模板DNA时），一般设定20～40次。循环次数越多，非特异性产物会随之增多，在满足获取足量PCR产物的情况下，尽量减少循环次数。

（四）PCR技术的种类

1.反转录PCR 反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）又称为逆转录PCR。由反转录和PCR两部分组成。第一步，利用随机引物或针对mRNA的poly（A）尾的oligo（dT） _n 引物在反转录酶的作用下，将RNA反转录为cDNA第一链。第二步，以cDNA第一链为模板DNA进行PCR扩增。RT-PCR广泛应用于目的基因克隆、探针制备、基因转录水平检测、RNA病毒检测等方面。

2.巢式PCR 巢式PCR（nested PCR）是一种提高靶序列扩增灵敏性和特异性的PCR方法，特别适合一次PCR难以获得所需要量的微量靶序列扩增，且可极大地提高扩增反应的特异性。该方法使用两对PCR引物扩增靶序列，首先用外侧序列设计的引物扩增包含靶序列在内的长DNA片段，然后使用第二对内侧引物进行扩增，内侧引物可结合在第一次PCR产物的内部，故将两对引物称为巢式引物。第二次PCR扩增产物片段长度小于第一次扩增产物。

3.实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）是一种可实时检测PCR进程、高灵敏度的核酸定量技术。因其定量准确、简单高效、特异灵敏的特点，已得到广泛的应用。根据扩增信号的检测方式，分为荧光探针法和荧光染料法两种。荧光探针是一段与被扩增基因互补的寡核苷酸序列，在其两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，淬灭基团会吸收报告基团发射的荧光信号；但PCR扩增时，DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性会将探针酶切并降解，使荧光报告基团与荧光淬灭基团分开，这时荧光监测系统能够接收到报告基团发出的荧光信号。每一条DNA新链形成，都会释放出一个荧光报告基团，因此荧光信号与PCR产物形成在数量上呈正相关（图2-5）。

荧光染料法是在PCR体系中加入SYBR GreenⅠ染料，这种染料能够与双链DNA结合。随着模板DNA的扩增，新的双链DNA也增多，与双链DNA结合的SYBR GreenⅠ染料也越来越多，使得仪器检测到的荧光信号逐渐增强，从而达到定量检测的目的（图2-6）。

4.不对称PCR 不对称PCR（asymmetric PCR）的关键点在于上下游引物的浓度比例相差较大，常为50∶1～100∶1。最初10～15个PCR循环的主要产物仍然为双链DNA，但当低浓度引物耗尽后，只由一条高浓度引物介导的PCR会产生大量的单链DNA。不对称PCR可用于制备探针，进行序列分析或核酸杂交。

5.多重PCR 多重PCR（multiplex PCR）指在同一反应中利用多组引物同时对几个不同的DNA片段进行扩增；当其中某一段DNA缺失，则电泳谱上相应的条带就会消失。多重PCR主要用于多个突变位点的检测和基因分型。

6.位点特异性PCR技术 位点特异性PCR技术是一种通过对生物DNA片段进行分析后，用特异性的引物进行PCR扩增，从而达到鉴定目的的一种方法。位点特异性PCR技术由于操作简单、快速的特点，其在中药鉴定方面应用广泛。目前已有研究采用位点特异性PCR技术对蛇、鹿类中药材进行了鉴定，并建立了金银花、何首乌、太子参、酸枣仁的分子鉴定方法。

7.DDRT-PCR技术 DDRT-PCR又称mRNA差异显示技术。该技术是利用mRNA3′端锚定引物进行反转录合成cDNA，然后通过PCR二次扩增，来显示mRNA中差异表达部分的技术。该技术因具有速度快、所需RNA量少和重复性高等优点，已被广泛用于中药研究当中。如研究热和盐胁迫下孔石莼不育突变体生理生化的改变、鉴定龙葵幼苗镉应答的基因等。 0yTuU6I/e6UgQrU4q6zvfKiAwQlP1Nx4gFsRI/rLJ4f4XTval4rmXHYyiltGssz4