好氧颗粒污泥污水处理技术最新章节_张翠雅著

2.8 荧光原位杂交

FISH原理是基于碱基互补配对原则，利用探针（已知的外源DNS或RNS碱基片段且经荧光标记）与待测样品进行杂交，荧光标记的特定寡糖核苷酸探针与待测样品靶序列专一性结合，通过荧光显微镜下检测杂交探针的荧光分析目标微生物种类定性、相对含量或空间分布。

FISH实验中所有物品在使用之前均需经过120℃高压灭菌，冷却后待用。

1）探针制备

实验中所用特异性探针均购自宝生物工程（大连）有限公司，见表2.2。其中探针EUB338用于标记绝大部分菌体，在实验中作为细菌背景对照。探针PSO651，PSO462和PSO846组成PSOmix，用于标记PSOs。探针GSO989 和GSOQ431 组成GSOmix，用于标记GSOs。探针NSO190的特异性目标菌是β- Proteobacterial 中的SOB，探针Nit3的特异性目标菌是 Nitrobacter spp.（一类公认的NOB），属于α- Proteobacterial 。

表2.2 相关FISH寡糖核苷酸探针

用无菌水将合成探针溶解，1OD-33μg，为了避免反复冻融探针储备液，将其逐级稀释至50 ng/μL，装于1.5 mL的灭菌后离心管中，避光保存置-20℃冰箱内。

2）药品和玻片准备

配制DEPC（diethylprocarbonate）水，DEPC是一种强烈抑制RNS酶的高效烷化剂，用于灭活各类蛋白质，在原位杂交过程和之前的处理步骤涉及的所有溶液均由DEPC水处理。在1 L蒸馏水中加入1 mL DEPC，迅速猛烈振摇，静置数小时后（室温）经高压灭菌去除降解的DEPC。一些试剂中可以直接加入DEPC，其最终浓度一般保持在0.1%~0.4%即可。

1 mol/L Tris-HCl溶液配制。将121.1g Tris溶于800mL无菌水中，利用HCl调节pH值至7.2，再用无菌水定容至1 000 mL，经高温灭菌后，冷却至室温备用。后续20 mmol/L Tris-HCl溶液是将1 mol/L Tris-HCl溶液稀释50倍后获得。

配制磷酸缓冲溶液（PBS），pH值7.2~7.4。称取7.605 g NaCl、0.994 g Na ₂ HPO ₄ 和0.36 g NaH ₂ PO ₄ 溶于500~800 mL DEPC水后，用蒸馏水将其定容于1 000 mL容量瓶中。依据甲酰胺浓度不同配制对应的杂交缓冲溶液，在灭菌后的离心管中，配制1 mL的杂交缓冲溶液，其中各试剂注入顺序和剂量见表2.3。溶液配制完毕后，经滤膜（孔径22μm）过滤后，于-20℃保存。

表2.3 杂交缓冲溶液配制

杂交后，需要用杂交清洗液小心洗脱未杂交的探针，杂交清洗液配制过程中要依据甲酰胺浓度不同选择性加入不同剂量的NaCl。50mL杂交清洗液中各试剂注入顺序和剂量见表2.4。

表2.4 杂交清洗液配制

玻片表面上可能残留的核苷酸会影响实验结果，在使用之前需要仔细清洗。配制1%的稀盐酸，将玻片浸泡24h，用去离子水反复冲洗，随后经95%的乙醇溶液脱水，待自然风干后，置于120℃烘箱内烘干4h。

为防止样品在玻片上杂交过程中出现脱落的现象，需要在玻片上包被明胶。首先配制明胶溶液，称量2.4 g明胶溶解于500~800 mL的水中，加热搅拌至完全溶解，而后加入2.4 g明矾，溶解后稀释至1000 mL。将明胶溶液加热到60℃左右，随后用镊子夹取清洗干净的玻片一角，在明胶溶液中上下浸蘸几次，保证完全包被后，将其竖直放置在架子上，在空气中自然风干后待用。

3）待测样品固定和杂交清洗

样品固定的目的在于保持样品的细胞结构，最大程度保留其中DNS或RNS，使细胞壁具有良好通透性，易于探针杂交和清洗。取反应器内污泥，在研钵中轻轻捣碎，以便充分观测好氧颗粒污泥内外全部微生物，随后将少许捣碎污泥转至2mL离心管内，注入少量PBS，超声2 min后使生物样品变为悬浮液，随后离心（8000 r/min，2 min），弃去上清液，再次用PBS清洗两遍。在清洗后的样品中注入1 mL 4%的多聚甲醛，放置在4℃冰箱中固定2h。随后弃去固定剂，用PBS清洗两次，最后将样品悬浮于等体积的PBS和100%乙醇溶液中，于-20℃保存待用。

取适量固定后样品均匀涂于明胶包被的玻片上，避免聚集，自然风干后，依次用50%、80%和100%的乙醇溶液脱水。待其干燥后进行杂交。将探针溶液和杂交缓冲溶液以体积比1:9均匀混合，用移液枪取适量混合液均匀涂在玻片上的样品上。然后将玻片放入46℃湿盒中杂交90min。作为对照，所有样品第一遍杂交均选取EUB338探针，杂交过后用相应杂交清洗液清洗，再进行目标探针的杂交。注意，在进行多个探针杂交时，需要依据甲酰胺浓度由低到高的顺序进行。另外，杂交一次后，需要认真清洗掉未结合的探针。即预先将杂交清洗液加热至48℃，用移液枪吸取少量清洗液轻轻地冲洗杂交过的玻片，随后，将玻片浸泡在清洗液中（48℃）10~15 min。随后用镊子取出玻片，用移液枪吸取冰浴无菌水清洗玻片，随后自然风干。

4）成像拍照

在杂交样品上放置盖玻片，利用CLSM观测，随后成像拍照。