第四节
真核生物RNA的合成

真核生物和原核生物RNA的转录合成遵循共同的规律，分为起始、延伸、终止和后加工四个阶段。其中延伸阶段基本相同，起始、终止和后加工差别明显。真核生物各种RNA合成的起始、延伸、终止阶段是一致的，区别主要在转录后加工和转录调控。此外，真核生物不同的RNA由不同的RNA聚合酶催化合成。真核生物转录复合物及其转录调控要比原核生物复杂得多。

一、转录起始

与原核基因相比，真核基因启动子结构复杂，RNA聚合酶需要通用转录因子的协助才能识别并结合于启动子，启动转录。

1.启动子 真核基因的启动子可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类，三种RNA聚合酶各识别其中一类。RNA聚合酶Ⅱ识别的Ⅱ类启动子（～100bp）种类最多，序列差异最大，以蛋白基因的启动子为主。 Ⅱ类启动子 结构特征尚未完全阐明，已从其序列中鉴定到两类启动子元件：① 核心启动子 （core promoter）：40～60nt，有方向性，位于-45～+20区，包括TATA盒、起始子、下游启动子元件等，功能是确定转录起始位点。② 上游元件 （upstream element）：又称上游启动子元件，无方向性，包括GC盒、CAAT盒等，功能是控制转录启动效率（图3-9）。

（1） 起始子 （initiator，Inr）：即解链起点，是含转录起始位点的一段保守序列，位于-2～+5区，哺乳动物共有序列是YY A ⁺¹ NWYY（W=T+A），其中 A ⁺¹ 是转录起始位点。pre-mRNA的5'末端碱基通常是嘌呤，特别是腺嘌呤。起始子是通用转录因子TFⅡD特定TAF亚基的识别结合位点。

（2） TATA盒 （TATA box）：又称Hogness盒，中心一般位于-25～-31区（酵母TATA盒位于-90区），共有序列是TATAAAA，是转录因子TBP（TATA结合蛋白）的识别结合位点、前起始复合物形成位点，作用是确定转录起始位点。TATA盒富含A-T碱基对，容易解链，有利于RNA聚合酶Ⅱ与启动子结合并启动转录，是RNA聚合酶Ⅱ稳定结合的序列。TATA盒在Ⅱ类启动子中出现率较高，常与起始子共存。

（3） 下游启动子元件 （downstream promoter element，DPE）：共有序列是RGWCGTG，中心位于+25～+32区，是转录因子TFⅡD的TAF6、TAF9亚基的识别结合位点。含起始子而不含TATA盒的基因多含下游启动子元件。

（4） CAAT盒 （CAAT box）：又称CAT盒，分布较散，多位于-70～-90区，是转录因子NF-Y（Nuclear transcription factor Y，异三聚体）的结合位点，作用是控制转录启动效率。

（5） GC盒 （GC box）：哺乳动物不含TATA盒的启动子内的一段保守序列，多位于-90区。GC盒长度为20～50bp，包含两段共有序列：GGGCGG和CCGCCC。它们互为反向重复序列，是转录因子Sp1（specificity protein 1）的结合位点，作用是控制转录启动效率。

不过，并非所有的Ⅱ类启动子都含上述启动子元件。对几千种蛋白基因启动子分析表明，30%只含起始子，30%含起始子和TATA盒，25%含起始子和DPE，15%含起始子、TATA盒和DPE。例如，猿猴空泡病毒40（SV40）的早期启动子含六个GC盒，不含TATA盒、CAAT盒；组蛋白H2B的启动子含一个TATA盒和两个CAAT盒。

2.转录因子 是参与RNA转录合成的一类蛋白因子。真核生物的三种RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录基因时分别需要Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类转录因子（TFⅠ、Ⅱ、Ⅲ）协助。RNA聚合酶Ⅱ需要一组转录因子，其中有些转录因子是与启动子结合的，称为 通用转录因子 （general transcription factor，基础转录因子），相当于原核生物σ因子（表3-5）。

TATA结合蛋白 （TBP）是唯一能识别并结合TATA盒的转录因子。然而，即使没有TATA盒的启动子也需TBP参与识别，且三类启动子都需要。TBP可以和一组 TBP相关因子 （TAFⅡ，包括TAF1～TAF13）组成TFⅡD。TFⅡD也能与不含TATA盒的启动子结合，机制是通过TAFⅡ与起始子、下游启动子元件等其他核心元件结合。TAFⅡ还可以与其他转录因子（转录激活因子和共激活因子，第六章，162页）结合。

●双向启动子 基因在基因组中的分布大都是随机的。研究发现，哺乳动物基因组中约10%的基因以 基因对 （gene pair）形式存在：它们的启动子反向串联于一段短的基因间区（＜1000bp）两翼，模板链不在同一股DNA 上，因而转录方向相背。它们可能受基因间区内同一调控序列调控。这种基因对被称为 双向基因对 （bidirectional gene pair），基因间区内的启动子和共用调控序列称为 双向启动子 （bi-directional promoter）。双向基因对的表达产物功能相关（例如同一异聚体蛋白的两种亚基、同一代谢途径的两种酶）且都很重要（例如DNA修复系统成员），因而在进化过程中很保守。双向基因对具有表达调控优势。

3.起始过程 转录起始是通用转录因子协助RNA聚合酶依托启动子形成转录复合物的过程（覆盖启动子-30～+30的60bp序列），以含TATA盒启动子为例（图3-10）。

（1）闭合复合物形成：TFⅡD（TBP-TAF1～13）通过TBP识别结合TATA盒而结合于启动子，通过β折叠插入小沟使TATA盒变形（特别是弯曲约80°，使小沟展宽），进而依次募集TFⅡA、TFⅡB、TFⅡF-RNA聚合酶Ⅱ、TFⅡE、TFⅡH，形成 闭合复合物 （ 转录前起始复合物 ，基础转录复合物）。

TBP与TATA盒的亲和力10 ⁵ 倍于其他序列，TBPTATA盒复合物解离常数约1nmol/L。TBP构象呈鞍型，凹面与TATA盒结合，致使其双链弯曲（富含AT序列柔性好），小沟展宽，与TBP的β折叠充分结合（主要是疏水作用）。TBP-TATA盒复合物不对称，对识别转录起始位点进而单向转录非常重要（图3-11）。

（2）开放复合物形成：TFⅡH是十亚基蛋白，由一个七亚基TFIIH核心复合物（XPB-XPD-GTF2H1-5，参与转录偶联的核苷酸切除修复）与1个三亚基CDK激活激酶CAK（cyclin H-CDK7-MNAT1）构成。XPB（3'→5'）、XPD（5'→3'）是依赖ATP的DNA解旋酶，可从起始子区解链11～15bp，使闭合复合物变构为 开放复合物 （ 转录起始复合物 ）。TFⅡE可能参与解链。

（3）RNA合成启动：TFⅡH中的CDK7（细胞周期蛋白激酶7）催化RNA聚合酶Ⅱ大亚基RPB1的C端结构域（RPB1-CTD）七肽单位中的Ser5磷酸化，导致开放复合物变构，启动RNA合成。和原核基因一样，真核mRNA转录合成多数也是从A开始（小鼠 Tlr 转录起始位点GCTCTCCT，第一碱基为G）。

（4）启动子清除：RNA合成至60～70nt时，转录延伸因子P-TEFb（正性转录延伸因子b，CDK9-cyclin T二聚体）中的CDK9（细胞周期蛋白激酶9）催化RPB1-CTD七肽单位中的Ser2磷酸化，致使RNA聚合酶Ⅱ释放TFⅡE、TFⅡH等大多数转录因子，转录进入延伸阶段。

二、转录延伸

RNA聚合酶与约50bp DNA保持结合，受核小体移位和重塑影响，转录速度较慢（10～ 40nt/s）。

真核基因的转录延伸与原核基因基本相同，不过RNA聚合酶Ⅱ始终与TFⅡF结合，并被RPB1-CTD募集的转录延伸因子（P-TEFb、ELL、SⅡ、SⅢ）激活，通过RPB1-CTD进一步募集RNA加工酶类等。研究表明，人胚胎干细胞约1/3基因的表达过程需要转录延伸因子。

起始阶段RPB1-CTD必须处于去磷酸化状态，以与增强子募集的共激活因子结合（图6-4，155页）。之后必须被CDK7、CDK9催化磷酸化，以摆脱大多数起始因子，进入延伸阶段，且在延伸阶段募集RNA加工酶系（Ser5募集加帽酶，Ser2募集剪接因子）进行转录后加工。

如果转录泡移动因遇到DNA损伤而中止时，TFⅡH可结合于损伤部位，募集核苷酸切除修复酶系修复损伤，模板链修复效率高于编码链。TFⅡH特定亚基遗传缺陷导致某些遗传病，如着色性干皮病、Cockayne综合征。

三、转录终止

真核蛋白基因的转录终止机制尚未阐明。哺乳动物蛋白基因的最后一个外显子中有一段保守序列，称为 加尾信号 （多腺苷酸化信号，polyadenylation signal），其共有序列是AATAAA。加尾信号下游10～30bp处是 加尾位点 （多腺苷酸化位点，polyadenylation site），加尾位点下游20～40bp处还有一段富含G/T或T的序列（图3-12）。mRNA转录终止与加尾同步进行。

1.切割 转录过加尾位点后，加尾信号AAUAAA依次募集聚腺苷酸化特异因子CPSF（有核酸内切酶活性）、剪切刺激因子（切割刺激因子，该因子同时与加尾位点下游富含G/U或U的序列结合）、剪切因子Ⅰ、剪切因子Ⅱ，最后募集poly（A）聚合酶。poly（A）聚合酶激活CPSF，CPSF从加尾位点切断转录产物。

2.加尾 poly（A）聚合酶以ATP为原料，在RNA的3'端合成200～250nt的poly（A）尾。

值得注意的是，只有RNA聚合酶Ⅱ的转录产物才会加尾。组蛋白基因转录发生于细胞周期S期，转录产物不加尾。

3.终止 切割、加尾之后，RNA聚合酶Ⅱ并未终止转录，而是继续转录，长度可达几千个核苷酸（称为额外RNA），之后才会终止转录，终止信号和终止机制尚未阐明。目前有以下两种终止模型。

（1） 变构模型 （allosteric model）：RNA切割导致转录泡构象改变，使RNA聚合酶Ⅱ延伸能力减弱，终止转录并与RNA、模板分离。

（2） 鱼雷模型 （torpedo model）：5'→3'核酸外切酶2结合于RNA加尾位点之后部分（还在继续转录）的无帽5'端，其催化RNA降解的速度快于RNA聚合酶Ⅱ合成的速度，因而追上RNA聚合酶Ⅱ，协助结合于RPB1-CTD上的辅助蛋白使RNA聚合酶Ⅱ终止转录并与模板分离。

转录终止时，RPB1-CTD去磷酸化，转录复合物解体，必要时启动新一轮转录。

四、转录后加工

RNA聚合酶转录一个转录单位得到一种初级转录产物，经过转录后加工得到功能RNA。转录单位可根据加工方式分为简单转录单位和复杂转录单位。

简单转录单位 （simple transcription unit）占人蛋白基因的5%，其初级转录产物只有一种剪接方式（个别甚至不需要剪接），因而最终只得到一种或一组功能RNA。简单转录单位有三种情况：①初级转录产物不加尾，不剪接，如核心组蛋白和大多数rRNA、tRNA基因。②初级转录产物只加尾，不剪接，如α干扰素、酵母大多数蛋白质、鸟类组蛋白H5基因。③初级转录产物既加尾，又剪接，但只有一种剪接方式，称为 组成性剪接 （constitutive splicing），如α、β珠蛋白基因和所有非编码RNA基因。

复杂转录单位 （complex transcription unit）占人蛋白基因的95%，其初级转录产物需要剪接，且有不止一种剪接方式（少则两种，多至几百种甚至几千种），称为 选择性剪接 （alternative splicing，又称可变剪接）。复杂转录单位均为蛋白基因，经过选择性剪接可以得到不同的成熟mRNA，指导合成不同的蛋白质。这些RNA及其编码的蛋白质统称 同源［异构］体 （isoform，剪接变异体，splicing variant）。成人多数组织只表达基因组10%～20%的基因，即2500～5000种基因（肝、肾表达10000～15000种），但却指导合成10000～20000种mRNA。每种基因平均指导合成4种mRNA。这主要是通过选择性剪接实现的。

（一）mRNA前体加工

人类几乎所有mRNA都要进行5'端加帽、剪接、3'端加尾，之后才会运出细胞核，指导合成蛋白质。催化mRNA前体加帽、剪接、加尾等的转录后加工因子均募集于磷酸化RPB1-CTD且相互结合，因而mRNA前体的各种后加工之间及其与转录合成之间相互协调。

真核蛋白基因大多数是断裂基因，其外显子和内含子都被转录，初级转录产物是 mRNA前体 （pre-mRNA）。pre-mRNA的平均长度是成熟mRNA的4～5倍（人类高达10倍），并且半衰期短（5～15分钟），只有一部分加工成为 成熟mRNA 。pre-mRNA加工过程如下（mRNA的转录“后”加工并非始于转录终止后）。

1. 5'端加帽 又称 mRNA加帽 。真核生物几乎所有mRNA的5'端都有一个特殊的三核苷酸结构，称为 5'帽子 。其第一个核苷酸是5'-磷酸-7-甲基鸟苷（5'-m7GMP），第二个是5'-二磷酸核苷（5'-NDP），两者通过5'-5'三磷酸连接（5'，5'-triphosphate linkage）。目前已经发现三种5'帽子结构，其中1型最多，但单细胞真核生物mRNA主要是0型，酵母甚至只有0型，2型见于脊椎动物RNA（图3-13，表3-6）。

5'帽子结构的作用：①募集帽结合复合物，介导5'外显子剪接及mRNA转运出核。②募集翻译起始因子eIF-4F，介导组装核糖体复合物，启动蛋白质合成。③抗磷酸酶重复降解，从而保护mRNA。

真核生物mRNA的5'帽子结构形成于转录延伸早期，当时RNA仅合成了20～30nt。催化加帽的酶就结合在RPB1-CTD七肽单位的磷酸化Ser5上。

mRNA加帽过程由加帽酶系（表3-7）催化：①HCAP1催化mRNA的5'-pppRpN二核苷酸水解脱去γ-磷酸，生成5'-ppRpN。②HCAP1催化5'-ppRpN与GTP缩合，生成GpppRpN。③RG7MT1催化G甲基化，形成m ⁷ GpppRpN（0型帽子）。④MTr1催化0型帽子R-2'- O -甲基化，形成m ⁷ GpppRmpN（1型帽子）。⑤MTr2催化1型帽子 N -2'- O -甲基化，形成m ⁷ GpppRmpNm（2型帽子）。加帽所需甲基来自 S -腺苷蛋氨酸（adoMet，供出甲基生成 S -腺苷同型半胱氨酸，adoHcy）（图3-14）。

许多非编码小RNA（sncRNA）也有5'帽子结构，例如剪接体sncRNA含三甲基帽子结构（含三甲基鸟嘌呤）。

2. 3'端加尾 又称 mRNA多腺苷酸化 。除组蛋白mRNA外，真核生物其他mRNA的3'端都有聚腺苷酸序列，其长度因不同mRNA而异，一般为200～250nt，该序列称为 poly（A）尾 或 多聚（A）尾 。加尾过程见图3-12。

poly（A）尾的作用：①参与蛋白质合成的起始和终止，提高翻译效率。②募集poly（A）结合蛋白（PABP）以保护poly（A），抗3'→5'外切酶降解，提高mRNA稳定性。poly（A）尾可使mRNA寿命延长至数小时甚至数日。组蛋白mRNA没有poly（A）尾，半衰期只有几分钟。一些细菌mRNA也有poly（A）尾，但却促进其降解。

在细胞核内完成加尾的mRNA转运到细胞质后，其poly（A）会被降解并导致mRNA降解。特殊情况下一些mRNA会在细胞质进行二次加尾，以延长寿命。有些mRNA先以无尾形式储存，翻译前再加尾。

其他RNA也有加尾修饰，如5S rRNA、U2-snRNA、SRP RNA、7SK RNA。

3. RNA编辑（RNA editing） 是指在转录后加工时通过非剪接方式改变RNA的编码区序列，即在mRNA中插入、删除或改变核苷酸，从而改变密码子，结果一个基因可以编码多种蛋白质。目前已有两种编辑机制被阐明。

（1）位点特异性脱氨基：多见于腺嘌呤和胞嘧啶脱氨基，分别形成次黄嘌呤和尿嘧啶。脱氨基发生于特定组织细胞且受到调控，例如人类载脂蛋白apo B-100和apo B-48是同一个基因 APOB 产物。①apo B-100：在肝细胞内， APOB 基因的初级转录产物在加工之后指导合成4563aa的多肽链，经过切除27aa的信号肽等翻译后修饰得到4536aa的apo B-100。②apo B-48：在小肠细胞中， APOB 基因初级转录产物的加工有所不同，一种小肠细胞特异性胞嘧啶脱氨酶（mRNA C-6666脱氨酶）与初级转录产物的第2180号密码子CAA（位于外显子26中，编码谷氨酰胺）结合，催化其胞嘧啶脱氨基成尿嘧啶，密码子CAA改造为终止密码子UAA，指导合成2179aa的多肽链，经过切除27aa的信号肽等翻译后修饰得到2152aa的apo B-48（图3-15）。

人脑组织谷氨酸受体2（GluR2，一种阳离子通道）mRNA发生Gln607Arg编辑（CAG→ CGG），编辑氨基酸位于第二段跨膜域内，是其生理功能必需的。未编辑型谷氨酸受体2允许多种阳离子通过，编辑型谷氨酸受体2阻止钙离子通过。人转录因子WT1的mRNA在睾丸会发生T839C编辑，导致Leu280Pro置换，置换后转录因子活性降低30%。

（2）gRNA指导的UMP插入/删除：在线粒体和叶绿体基因RNA最常见。锥虫（trypanosomes）线粒体几种蛋白质pre-mRNA的后加工过程发生尿嘧啶插入或删除导致密码子甚至阅读框改变，例如其细胞色素氧化酶亚基Ⅱ-mRNA的一段序列发生如下编辑：GAG-AAC-CU→GA U- U G U A U A-CCU。该编辑依赖 指导RNA （guide RNA，gRNA，一种60～80nt的线粒体RNA，含被编辑RNA的互补序列）定位和一组酶催化，插入的 U 来自gRNA的poly（U）（图3-16）。该编辑既导致密码子改变，又发生 -1移码 （第六章，177页）。

一种真核基因通过编辑可以编码多种氨基酸序列不同的蛋白质，这不但丰富了基因的信息量、基因产物的多样性，而且还和生物发育有关，是基因表达调控的一个环节，使生物可以更好地适应生存环境。

某些microRNA后加工时发生A脱氨基编辑（第六章，176页）。

4.修饰 除了在5'帽子结构中有1～3个甲基化核苷酸之外，真核生物许多mRNA分子内部也有1～2个 N ⁶ -甲基腺嘌呤，常见于5'非翻译区（第四章，99页）。 N ⁶ -甲基腺嘌呤是在pre-mRNA剪接之前由特异RNA甲基化酶催化形成的。真核生物mRNA的化学修饰会影响到mRNA与RNA结合蛋白的相互作用，从而在翻译水平影响基因表达。

加帽、加尾、剪接体系并不是各行其是，它们在RPB1-CTD上有序组装，加工时相互协调，与转录同步（cotranscription），与转录延伸偶联（couple）。

从mRNA转录、转录后加工到向细胞质转运，先后有几十种蛋白质参与，它们与mRNA形成一种复杂的动态超分子结构（supramolecular），称为 信使核糖核蛋白［体］ （messenger ribonucleoprotein，mRNP）。mRNP的蛋白质组成随mRNA加工、运输和翻译而变，它们决定着mRNA的运输、翻译和归宿。

（二）rRNA前体加工

真核生物rRNA基因的拷贝数较高，通常有几十到几千个，并且形成基因簇。每个转录单位由18S、5.8S、28S rRNA基因及外转录间隔区、内转录间隔区组成，在核仁区由RNA聚合酶Ⅰ催化转录，合成 rRNA前体 （哺乳动物rRNA前体45S），经过修饰与切割，得到3种 成熟rRNA （图3-17）。大多数真核生物的5S rRNA基因自成转录单位，由RNA聚合酶Ⅲ催化转录。rRNA与核糖体蛋白聚合成核糖体大亚基和小亚基。

真核生物rRNA前体加工类似原核生物，包括内切酶或外切酶催化的切割、核苷酸修饰，部分RNA前体加工还包括内含子剪接。rRNA前体加工始于核仁。在加工因子的协助下，还在转录延伸阶段的rRNA边合成边与核糖体蛋白组装成大的核糖核蛋白，例如小亚基（small-subunit，SSU）加工体（processome）结合于pre-rRNA的5'端，介导18S rRNA加工。rRNA转录、后加工和核糖体组装在核仁内偶联进行，一气呵成。每个复合物包含切割rRNA前体的核酸酶、碱基修饰酶、snoRNA、核糖体蛋白。酵母rRNA前体加工需要超过170种非核糖体蛋白、约70种指导碱基、核糖修饰的snoRNA和78种核糖体蛋白。人rRNA约有200种修饰核苷，因而需要更多的snoRNA和蛋白质参与。

1.核糖和碱基修饰 主要是核糖甲基化和形成假尿苷酸。人rRNA有115个核糖2'- O -甲基化（依赖40多种C/D snoRNP），95个尿苷酸变位成假尿苷酸（依赖20多种H/ACA snoRNP），每一种snoRNP都由一种snoRNA和4～5种组装蛋白（包括修饰酶）构成。

snoRNA （ 核仁小RNA ，small nucleolar RNA，属于snRNA）长60～300nt，许多为其他RNA前体内含子序列的转录后加工产物。每一种snoRNA都有一段10～21nt序列（反义元件）与rRNA修饰位点旁序列完全互补，为修饰酶指示rRNA修饰位点。snoRNA还含有两类关键元件，作用是折叠成特定构象，进而募集相关蛋白组成 snoRNP （ 核仁小核糖核蛋白 ）：①H/ACA盒（box H/ACA）：含H盒（box H，共有序列ANANNA）和ACA盒（box ACA，共有序列ACA），组成的 H/ACA snoRNP 参与假尿嘧啶核苷化。②C/D盒（box C/D）：组成的 C/D snoRNP 参与2'- O -甲基化。

2.亚基组装和rRNA前体切割 与大肠杆菌一样，真核生物rRNA加工与亚基组装同步进行。始于核仁，完成于核质。切割在亚基组装完成后进行，由多种核酸内切酶和核酸外切酶催化进行。

亚基转至细胞质后还要进行其他修饰，故后加工始于细胞核仁，完成于细胞质。

（三）tRNA前体加工

真核生物tRNA基因由RNA聚合酶Ⅲ催化转录合成 tRNA前体 ，加工得到 成熟tRNA ，其加工与原核生物一致（图3-18）。

1.切割 tRNA前体5'前导序列由内切酶RNase P切除，3'尾随序列由核酸外切酶RNase Z等核酸酶切除。

人RNase P由一个催化RNA（H1）和至少十个蛋白亚基构成，参与RNA聚合酶Ⅲ催化合成的各种RNA的加工，包括tRNA、5S rRNA、7SL RNA、U6 snRNA。

2.加接3'CCA 真核生物几乎所有tRNA前体都没有3'CCA，要在加工时添加，由CCA tRNA核苷酸转移酶催化，不需要模板，加接反应在细胞核和细胞质进行。

3.剪接 人类基因组有509个tRNA基因，其中32个有一个14～60nt的Ⅳ型内含子，位于反密码子下游且只隔一个核苷酸。在加工时，该内含子由一种剪接核酸内切酶（splicing endonuclease）切除（形成5'-羟基和3'-磷酸基），再由一种tRNA剪接酶复合体将两个外显子连接起来（消耗GTP），这一过程称为 tRNA剪接 ，反应在细胞核内进行。

4.碱基修饰 包括甲基化、还原、脱氨、糖苷键重排，有的发生于剪接前，有的发生于剪接后；有的发生于细胞核，有的发生于细胞质。

5.加接5'G 组氨酸tRNA没有5'G，由组氨酸tRNA鸟苷酸转移酶催化加接，反应在细胞质中进行。

（四）RNA剪接

真核生物经过加工去除断裂基因初级转录产物中的内含子，连接外显子，得到功能RNA，这一过程称为 RNA剪接 （RNA splicing）。

1.内含子分类 内含子存在于mRNA、rRNA和tRNA前体中，可根据剪接机制的不同分为四类。染色体基因组蛋白基因主要含Ⅲ型内含子，又称剪接体内含子（表3-8）。

2.Ⅲ型内含子剪接 存在于真核生物pre-mRNA中的Ⅲ型内含子通过形成剪接体进行剪接。 剪接体 （spliceosome，60S）是由5种核内小核糖核蛋白（snRNP）与300多种其他剪接因子组装于Ⅲ型内含子上形成的复合体，是真核细胞最复杂的超分子复合物。剪接体所含RNA成分是各种剪接步骤的催化剂，整个剪接体可被视为具有柔性结构的核糖核蛋白酶，可适应细胞核中序列和大小均差异极大的各种pre-mRNA。

（1） 核内小核糖核蛋白 ：是参与RNA剪接的主要 剪接因子 （splicing factor），是含 核内小RNA （核小RNA，small nuclear RNA，snRNA）的核蛋白。 snRNA 是真核生物细胞核内的一类小RNA，每一种都与特定蛋白形成snRNP。多细胞真核生物snRNA长度90～300nt，在不同的真核生物中高度保守，其中一部分因富含尿嘧啶而用U和数字编号命名。在哺乳动物细胞核内已经发现了十几种snRNA：①U1、U2、U4、U5和U6（长度106～185nt）位于核质内，参与形成剪接体，参与pre-mRNA的剪接。其中U6是核酶。②U7参与组蛋白pre-mRNA 3'端的加工。③U3（U3 snRNA，U3 snoRNA）主要位于核仁内，参与rRNA前体的加工及核糖体组装（表3-9）。

此外有些snRNA有其他功能。例如，7SK RNA（280nt）调节转录因子活性，B2 RNA调节RNA聚合酶Ⅱ活性，端粒酶RNA作为指导端粒合成的模板。

（2）Ⅲ型内含子：绝大多数 Ⅲ型内含子 含三段保守序列，称为 剪接信号 ：①5'端的二核苷酸序列 GU 位于 5'剪接位点 （5' splice site），又称 剪接供体 （splice donor，SD）内（脊椎动物共有序列为AG- GU AAGU），可以与U1的5'端序列互补结合，形成双螺旋结构。②3'端的二核苷酸序列 AG 位于 3'剪接位点 （3' splice site），又称 剪接受体 （splice acceptor，SA）内（脊椎动物共有序列为Y ₁₀ NC AG -GU）。上述Ⅲ型内含子末端序列的保守特征称为 GT- AG规则 （GTAG法则）。③3'剪接位点上游18～50nt处的一段富含嘧啶的序列，可以与U2互补结合。该序列中有一个特定的 A ，称为 分支点 （intron branch site，酵母共有序列UACUA A C，动物共有序列YNYYR A Y，图3-19）。

Ⅲ型内含子以符合GT-AG规则的U2型为主（占人类基因组Ⅲ型内含子的98%以上），另有少量符合GT-AG规则的U12型和符合AT-AC规则的U12型。

（3）转酯反应：Ⅲ型内含子剪接过程是先组装剪接体，再发生两步转酯反应（transesterification reaction）：①第一步转酯反应：又称 2'- 3'转酯反应 ，分支点A的2'-羟基亲核攻击上游外显子（upstream exon）3'端的3'-磷酸酯键（内含子5'端磷酸基），使其断开，释放上游外显子3'端羟基，内含子5'端则形成含2'，5'-磷酸二酯键的 内含子套索 （intron lariat）。②第二步转酯反应：又称 3'- 3'转酯反应 ，上游外显子3'端羟基亲核攻击内含子3'端的3'-磷酸酯键（内含子3'端磷酸基），使其断开，释放内含子套索，并使上游外显子3'端与下游外显子（downstream exon）5'端以3'，5'-磷酸二酯键连接（图3-20）。

（4）剪接过程：①形成A复合物：U1 snRNP通过暴露于表面的snRNA保守的6nt序列ACUUAC与5'剪接位点互补结合。U2 snRNP在剪接因子U2AF和SF1（BBP）的协助下通过碱基配对结合于分支点（消耗ATP），形成 A复合物 （A complex），且A凸出，便于与5'剪接位点进行转酯反应。②形成B复合物：U4、U5、U6 snRNP预组装为三联体（tri-snRNP），通过U4 snRNP结合于U2 snRNP（消耗ATP），形成 B复合物 （又称无活性剪接体），此时内含子弯曲，上游外显子与下游外显子相互靠近。③形成C复合物：U6 snRNP取代U1 snRNP与5'剪接位点结合，U1 snRNP释放。U6 snRNP取代U4 snRNP与U2 snRNP结合形成活性中心，U4 snRNP释放，分支点靠近5'剪接位点，形成 C复合物 （又称活性剪接体）。④转酯反应（图3-21）。

剪接过程有多个步骤消耗ATP，用于RNA解旋酶解链以便于碱基变更配对及snRNP释放。剪接体中有8种蛋白质是ATPase。如果把剪接体视为一个酶蛋白，则它是一种一次性转换酶，每组装一次只能切除一个内含子。因此，每切除一个内含子都要经历组装、激活、催化、释放等环节。

上述剪接GU-AG内含子的剪接体称为 主要剪接体 。人类基因组约1%内含子是AU-AC内含子，由次要剪接体剪接。 次要剪接体 不含U1、U2、U4、U6 snRNP，取而代之的是U11、U12、U4atac、U6atac snRNP。

3.选择性剪接 是指一种pre-mRNA有不止一种剪接方式，因而得到不同的成熟mRNA同源体，它们指导合成不同功能的蛋白质。选择性剪接由剪接体中的反式剪接因子与pre-mRNA中顺式剪接元件的结合决定，因而具有组织特异性或条件特异性，即在不同发育阶段、不同组织细胞或受到不同信号刺激时发生不同的剪接。例如，同一pre-mRNA在人甲状腺经过选择性剪接得到降钙素mRNA（翻译产物调节钙磷代谢），在人脑经过选择性剪接得到降钙素基因相关肽mRNA（翻译产物是一种血管扩张剂）（图3-22）。选择性剪接既极大增加了蛋白质多样性，又是一种有效的基因表达调控方式。人类基因组中每个基因平均有4种剪接方式。选择性剪接大大增加了蛋白质的多样性，以支持更复杂的生命活动，但也使蛋白质组比基因组更复杂。

4.异常剪接 选择性剪接与细胞分化、个体发育等关系密切。在点突变导致的遗传病中，至少有15%是因为发生 剪接［位点］突变 （splicing mutation）导致 异常剪接 （aberrant splicing）。例如，人类基因组有两个 SMN 基因， SMN1 和 SMN2 。只有SMN1-mRNA可以正常剪接得到成熟mRNA，指导合成功能蛋白。SMN2-mRNA中有一段RNA沉默子序列，它可导致SMN1-mRNA外显子7被切除，因而不能指导合成功能蛋白。健康个体通过表达 SMN1 即可得到SMN蛋白，用以组装snRNP，进而组装剪接体， SMN1 突变个体SMN1-mRNA内含子6的3'剪接位点发生突变，导致pre-mRNA异常剪接，丢失外显子7，翻译产物很快就被降解，导致脊髓运动神经元过早死亡，发生脊髓性肌萎缩症，通常在两岁前死亡。用于治疗脊髓性肌萎缩症的诺西那生（XM09）是一种人工合成18mer反义寡核苷酸，与SMN2-mRNA沉默子序列互补，可以矫正其选择性剪接方式，保留外显子7，得到成熟mRNA，指导合成功能SMN蛋白。

一些病毒基因的表达过程也发生选择性剪接，例如猿猴空泡病毒40（SV40）的早期基因初级转录产物通过5'选择性剪接生成大T抗原（LT-AG）和小t抗原（ST-AG）mRNA。 ae90Q+sOAU6Yj6wvJPtcfdtanVeDYzPZryuuVPzCy/uwmy3whzxp3O/ecAFAhcEj