第三节
原核生物RNA的合成

本节以大肠杆菌K-12株为例介绍原核生物RNA的合成和降解。大肠杆菌RNA的转录合成分为起始、延伸、终止和后加工四个阶段。起始阶段需要RNA聚合酶全酶催化，其所含的σ因子协助核心酶识别并结合于启动子元件，延伸阶段需要核心酶催化，终止阶段有的需要ρ因子参与。

一、转录起始

转录起始是基因表达的关键阶段，核心内容就是RNA聚合酶全酶识别并结合于启动子，形成 转录起始复合物 ，启动RNA合成。

1.启动子 是RNA聚合酶识别、结合和赖以启动转录的一段DNA序列，长度40～70bp，位于5'侧翼区（5'-flanking region，-70～+30区），具有方向性，包含以下元件（图3-3）。

（1） Sextama盒 （Sextama box）：共有序列T ₈₂ T ₈₄ G ₇₈ A ₆₅ C ₅₄ A ₄₅ （下标表示该碱基出现的频率），是RNA聚合酶依靠σ因子识别并初始结合的位点，因而又称RNA聚合酶识别位点。中心多位于-35号核苷酸处，故又称 -35区 、-35序列。

（2） Pribnow盒 （Pribnow box）：共有序列T ₈₀ A ₉₅ T ₄₅ A ₆₀ A ₅₀ T ₉₆ ，是RNA聚合酶依靠σ因子识别并牢固结合的位点，因而又称RNA聚合酶结合位点。中心多位于-10号核苷酸处，故又称 -10区 、-10序列。Pribnow盒富含A-T碱基对，容易解链，有利于RNA聚合酶启动解链和转录。

（3） 转录起始位点 （transcription start site）：许多位于共有序列C A ⁺¹ T内。

（4） 上游元件 （upstream element）：位于部分高表达基因（如rRNA基因）强启动子（第五章，138页）的-40～-60区，是富含AT的识别元件、RNA聚合酶α亚基C端结构域直接识别和结合的位点。

2.起始过程 大肠杆菌的转录起始过程分四步（图3-4）。

（1）结合：RNA聚合酶全酶寻找启动子（速度≥10 ³ bp/s），通过其σ因子与启动子区结合，形成 闭合复合物 （closed complex），覆盖约55bp（-55～+1）。

（2）解链：RNA聚合酶全酶从-10区内到+2或+3之间将DNA解开12～17bp（-11～+2，包含转录起始位点），形成 开放复合物 （open complex），覆盖60～80bp（-55～+20）。解链不消耗ATP。

大肠杆菌RNA聚合酶核心酶与DNA的结合是非特异性的，在与σ因子结合成全酶时获得特异性，表现为与其他位点的亲和力下降到原来的1/10 ⁴ （半衰期不到1秒），与启动子的亲和力则增强10 ³ 倍（半衰期可达数小时），从而与启动子形成特异性结合。

（3）合成：RNA聚合酶全酶根据模板链指令获取第一、二个NTP，形成3'，5'-磷酸二酯键，启动RNA合成。90%以上基因转录产物的第一个核苷酸是嘌呤核苷酸，而且大多数是腺苷酸：

注意：第一个核苷酸在形成磷酸二酯键之后，将保留其5'端的三磷酸基，用于转录后加工时加帽。

（4）释放：RNA聚合酶全酶催化合成10nt的RNA片段之后，σ因子释放，同时有NusA蛋白与之结合，导致核心酶构象改变，与启动子的亲和力下降，于是沿着DNA模板链向下游移动（称为 启动子清除 、 启动子逃逸 ），把转录带入延伸阶段。

大肠杆菌转录起始的上述四步很多时候并不是一步到位的：开放复合物的RNA出口被σ因子阻挡（图3-5），需由新合成的RNA疏通。有时疏通失败导致2～9nt新合成的RNA片段释放。RNA片段的释放意味着启动失败，需要重新启动转录，这一现象称为 流产式启动 （abortive synthesis），它会影响到转录启动效率。

当一个核心酶沿着转录区向下游转录时，另一个转录起始复合物开始形成。以大肠杆菌色氨酸操纵子为例，每分钟形成约15个转录起始复合物。

二、转录延伸

在这一阶段，核心酶沿着DNA模板链3'→5'方向移动（覆盖30～35bp），使转录区保持约17bp解链；同时，NTP按照碱基配对原则与模板链结合，由核心酶催化，通过α-磷酸基与RNA的3'-羟基形成磷酸酯键，使RNA链以5'→3'方向延伸（50～100nt/s）。这时的转录复合物称为 转录泡 （transcription bubble，延伸复合物，elongation complex）。在转录泡上，RNA的3'端8～9nt与模板链结合，形成RNA-DNA杂交体，5'端则脱离模板链甩出；已经转录完毕的DNA模板链与编码链重新结合（图3-6）。转录过程中在下游形成正超螺旋，由DNA促旋酶通过引入负超螺旋松弛；在上游形成负超螺旋，由DNA拓扑异构酶1松弛。

RNA聚合酶没有独立的3'→5'外切酶活性中心，错配率比DNA聚合酶高。因为一个基因通常会指导合成许多RNA，这些RNA几乎都是一次性的，最终都会降解，需要时再合成，所以其错配的不利影响远小于DNA复制。即使如此，许多RNA聚合酶，包括细菌RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶Ⅱ，一旦发生错配也会通过校对纠正，切除错配核苷酸，将错配率降至10 ^-5 ～10 ^-4 。校对机制有两种：① 焦磷酸解编辑 （pyrophosphorolytic editing）：通过聚合反应的逆反应使错接的NMP与PP _i 重新生成NTP。② 水解编辑 （hydrolytic editing）：RNA聚合酶停顿、后退1～2nt，从RNA的3'端切除错接的NMP，或含错接NMP的2nt，然后继续转录。大肠杆菌RNA的水解编辑需要辅助因子（accessory factor）GreA或GreB的协助。

如果转录泡移动因遇到非组蛋白阻挡或DNA损伤等而中止，RNA聚合酶会募集一种转录-修复偶联因子TRCF。TRCF会促使转录泡解体并募集修复系统修复损伤，或推动停滞不前的转录泡继续移动。

三、转录终止

转录终止由位于转录产物末端的转录终止信号序列控制。核心酶转录过转录终止信号后，RNA、NusA蛋白先后脱离核心酶，核心酶脱离DNA，再次结合σ，启动下一轮转录。转录终止信号又称 终止子 （terminator），是位于转录区下游的一段DNA序列，最后才被转录，所以编码RNA前体的3'端。原核基因的终止子有两类：一类不需要转录终止因子ρ协助（ρ-independent）就能终止转录，另一类则需要ρ因子协助（ρ-dependent）才能终止转录。在细菌基因组中，两类终止子各占50%。

1.不依赖ρ因子的终止子 又称内在终止子（intrinsic terminator），其RNA序列大多数有两段保守序列。①反向重复序列：长15～20nt，富含G/C，可以形成发夹结构。②U序列：又称oligo（U），长3～8nt，与反向重复序列串联，与模板链以最弱的dA-rU对结合（图3-7）。

发夹结构一方面作用于β亚基的一个β-flap结构域，使转录复合物停滞于U序列；另一方面解开dA-rU碱基对并削弱RNA与核心酶的结合，使RNA-DNA杂交区解链，RNA释放。

2.依赖ρ因子的终止子 这类基因转录产物有两段保守序列：①反向重复序列：可以形成发夹结构，但之后不含U序列，所以本身不能终止转录。② rut位点 （rho utilization site， rut site）：又称rut元件（ rut element），约40nt，富含C或CA而少含G，位于转录产物上游，可募集ρ因子。

ρ因子 （转录终止因子ρ、ρ蛋白、解旋酶ρ）与解旋酶DnaB同源，是一种环状同六聚体蛋白，含量约为RNA聚合酶的10%，有依赖RNA的ATP酶活性（被双环霉素抑制）和依赖ATP的RNA-DNA解旋酶活性，可以与rut位点结合，沿mRNA的5'→3'方向前移，作用于已到达终止子的转录泡，使杂交体解链，RNA释放（分子机制尚未阐明）。ρ因子由J. Roberts于1969年发现于T4噬菌体感染的大肠杆菌。

有时RNA聚合酶转录到终止子序列时并不终止，而是继续向下游转录，这种现象称为 连读 、 通读 （read-through）。有一类称为 抗终止因子 的辅助因子（ancillary factor）通过作用于RNA或RNA聚合酶启动连读，称为 抗终止作用 。

四、转录后加工

RNA聚合酶催化合成的初级转录产物是各种 RNA前体 （pre-RNA，nascent RNA chain）。大肠杆菌mRNA前体不需要加工，可以直接指导蛋白质合成，而rRNA前体和tRNA前体则需要经过加工才能成为功能RNA。加工包括核酸酶水解、RNA片段切除、碱基和核糖修饰。

1. mRNA前体加工 大肠杆菌蛋白基因的 mRNA前体 （pre-mRNA）平均长度为1200nt，一般不用加工，可以直接翻译，并且往往是边转录边翻译。

2. rRNA前体加工 大肠杆菌有7个rRNA基因，其7种 rRNA前体 （pre-rRNA，30S，约6500nt）均包含16S rRNA、23S rRNA、5S rRNA、tRNA、 外转录间隔区 （external transcribed sequence，ETS）和 内转录间隔区 （internal transcribed spacer，ITS）序列，其中四种rRNA前体的16S rRNA和23S rRNA之间有一个tRNA，另外三种有两个tRNA（或均位于16S、23S之间，或第二个位于5S的3'端，即3'ETS区）。它们经过以下加工得到 成熟rRNA 和成熟tRNA（图3-8）。rRNA与核糖体蛋白聚合成核糖体大亚基和小亚基。

（1）碱基和核糖修饰：迄今已在rRNA中发现有核糖2'- O -甲基化和30种碱基修饰（主要是甲基化），每种修饰都由特定酶催化。①16S rRNA酶促修饰形成10个甲基化核苷酸（包括碱基甲基化和2'- O -甲基化，多位于3'端）、1个假尿苷酸。②23S rRNA酶促修饰形成20个甲基化核苷酸、10个假尿苷酸、1个二氢尿嘧啶核苷酸。

（2）切割：分别由RNase Ⅲ、RNase P和RNase E催化切割不同位点（图3-8②，图中分别以Ⅲ、P、E表示）。

（3）修剪：分别由RNase M16、M23和M5进一步修剪，得到功能RNA。

（4）亚基组装：rRNA转录、加工与核糖体亚基组装同步进行，即边转录边加工边组装，前述各项加工大部分是在核糖核蛋白状态下进行的，加工过程中有核糖体蛋白（r-protein）适时附着，也有加工因子（assembly factor）适时离去。加工完成即意味着形成30S小亚基和50S大亚基。

3. tRNA前体加工 大肠杆菌的tRNA基因大多数形成基因簇，有的转录单位是多拷贝单一tRNA基因，有的转录单位含几种不同tRNA基因，有的与rRNA基因、蛋白基因共同组成转录单位。 tRNA前体 （pre-tRNA）依次经过以下加工得到 成熟tRNA 。

（1）切割：tRNA前体5'前导序列由内切酶RNase P切除，形成成熟5′端；3'尾随序列由一种核酸内切酶和一组核酸外切酶切除，直至暴露出CCA序列为止。

大肠杆菌RNase P是一种核酶、核酸内切酶，由一个催化RNA（M1）和一个蛋白亚基（C5）构成。

（2）加接3'CCA：部分tRNA的3'CCA是后加的，反应由 tRNA核苷酸转移酶 （tRNA nucleotidyl transferase）催化。该酶很特别，有三个活性中心，分别结合一个CTP、CTP、ATP，依次加接，形成3'CCA，因此反应不依赖DNA或RNA模板。

（3）碱基修饰：成熟tRNA分子含较多的稀有碱基，它们都是在tRNA前体水平上由常规碱基通过酶促修饰形成的，修饰方式包括嘌呤碱基甲基化为甲基嘌呤、腺嘌呤脱氨基成次黄嘌呤、尿嘧啶还原成二氢尿嘧啶、尿苷酸变位成假尿苷酸或甲基化为胸腺嘧啶核糖核苷酸等。目前已经发现了81种修饰方式（含真核生物tRNA），如硫尿嘧啶（S ⁴ U）、次黄嘌呤（I）、1-甲基鸟嘌呤（m ¹ G）、 N ⁶ -异戊烯基腺嘌呤（i ⁶ A）。修饰效应：抗降解，形成翻译识别标志。 +H9SX63B3K4hQkochzKeXzPn3GrgzKafaedCD57xJSqWgCT7oEiL5nOIWlp1f++H