第七节
DNA的逆转录合成

逆转录 （反转录，reverse transcription）是以RNA为模板，以dNTP为原料，由逆转录酶催化合成DNA的过程。这是一个从RNA向DNA传递遗传信息的过程，与转录时从DNA向RNA传递遗传信息的方向相反，所以称为逆转录。逆转录病毒以RNA为遗传物质，复制时必须先由其RNA基因组指导合成DNA。

1.逆转录酶 1962年，H. Temin提出RNA病毒可能存在逆转录酶。1970年，D. Baltimore和H. Temin（1975年诺贝尔生理学或医学奖获得者）报道致癌RNA病毒携带逆转录酶，能以RNA为模板指导DNA合成，所以这类病毒又称 逆转录病毒 （retrovirus）。

逆转录病毒有以下四个特征：①是唯一的二倍体病毒。②是唯一完全利用宿主细胞的转录系统合成基因组的RNA病毒。③是唯一以宿主细胞特定RNA（tRNA）为引物进行复制的病毒。④是唯一在感染之后不能直接指导蛋白质合成的正链RNA病毒（第三章，95页）。

逆转录病毒的逆转录由逆转录酶催化进行。其 逆转录酶 （reverse transcriptase）又称依赖于RNA的DNA聚合酶（RDDP），有两个活性中心，催化三个反应。

（1）聚合酶活性中心：由一级结构前2/3构成，以两个Mg ²⁺ 为辅助因子，催化两个反应。①逆转录：以逆转录病毒基因组RNA为模板，逆转录合成 单链互补DNA （sscDNA），形成RNA-DNA杂交体。该合成反应需要引物提供3'-羟基，该引物是逆转录病毒颗粒自带的一种tRNA。②复制：以游离的单链互补DNA为模板，复制合成 双链互补DNA （dscDNA）。单链互补DNA和双链互补DNA统称 互补DNA （cDNA）。

一个逆转录病毒颗粒可以携带50～100个不同种类的tRNA分子，它们是在包装病毒颗粒时从宿主细胞获得的。不同的逆转录病毒以不同的tRNA作为引物。例如HIV-1的引物是tRNA ^Lys ，莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV，M-MuLV）的引物是tRNA ^Pro 。

（2）核糖核酸酶H活性中心：由一级结构后1/3构成，以两个Mg ²⁺ 为辅助因子，催化RNA-DNA杂交体中的RNA降解（所以命名为RNase H、核糖核酸酶H；H：hybridation），得到游离的单链互补DNA。

逆转录酶的聚合酶活性中心没有3'→5'外切酶活性和5'→3'外切酶活性，所以在逆转录合成DNA过程中不能校对，错配率较高（2×10 ^-4 ，在体外高浓度dNTP和Mg ²⁺ 下，错配率高达2×10 ^-3 ），因而逆转录病毒突变率高，容易形成新病毒株。

逆转录酶在体外可用于逆转录各种RNA，在宿主细胞内只能逆转录逆转录病毒自己的基因组RNA。

（3）逆转录酶抑制剂：①恩曲他滨属于全身用抗病毒药（XJ05），既是核苷及核苷酸类逆转录酶抑制剂（XJ05AF），又是艾滋病病毒感染的抗病毒药物（XJ05AR），通过抑制逆转录酶抑制HIV复制，还可联合替诺福韦（XJ05AF）抑制HBV复制。②齐多夫定（XJ05AF，XJ05AR）是脱氧胸苷类似物，是第一种被批准临床应用的抗艾滋病药物，被T细胞摄取后转化为三磷酸酯，与HIV逆转录酶亲和力大于dTTP，因而竞争性抑制dTTP结合。此外，齐多夫定无3'-羟基，因此连接至HIV-DNA的3'端致使其合成流产。

● 齐多夫定与细胞DNA聚合酶亲和力弱于dTTP，1～5μmol/L浓度下只影响逆转录，不影响细胞DNA复制，故对多数细胞无毒，但对骨髓细胞有毒性，因而会令患者出现贫血。

2.逆转录病毒基因组 逆转录酶是逆转录病毒基因组的表达产物。逆转录病毒基因组是mRNA，含5'帽子结构和poly（A）尾（第三章，87页）。其指导合成的双链互补DNA称为前病毒（provirus）。前病毒可以整合到宿主染色体DNA中，随之复制和表达，一定条件下可诱导宿主细胞癌变，因此逆转录病毒又称致癌RNA病毒。人类免疫缺陷病毒（HIV）属于逆转录病毒，是艾滋病的病原体。

各种逆转录病毒虽然大小不同，但是结构相似，都含有两个相同的正链基因组RNA拷贝（长度约为10000nt），其编码序列中含调控元件（图2-46）。

（1） 翻译区 （ORF）：典型的逆转录病毒基因组包含以下3个基因：① gag ——编码一种基质蛋白和三种衣壳蛋白。② pol ——编码蛋白酶PR、逆转录酶RT和整合酶IN。③ env ——编码两种包膜蛋白，包膜蛋白赋予病毒感染性和宿主特异性。此外，有些逆转录病毒基因组还携带癌基因，例如Rous肉瘤病毒（劳斯肉瘤病毒，RSV）基因组携带癌基因 src 。

（2） 包装信号 （packaging signal）：又称包装元件，为包装病毒颗粒所必需。

（3） 长末端重复序列 （LTR）：为前病毒整合及转录所必需。完整的长末端重复序列长250～ 1400bp，包括以下序列：①U3——3'非翻译区（3' UTR，170～1260nt，含启动子、增强子）。②R——重复序列（10～97nt，含加尾信号，且参与整合）。③U5——5'非翻译区（5' UTR，80～100nt）。仅前病毒DNA的长末端重复序列（LTR）是完整的，且两端存在短反向重复序列（即U5的3'端与U3的5'端存在短反向重复序列）。

（4） 引物结合位点 （PBS）：为逆转录所必需。PBS位于5' UTR下游，距离5'端100～200nt，可与tRNA引物3'端的18nt配对。

（5） 多嘌呤序列 （PPT）：为复制所必需。PPT与U3相邻，富含嘌呤序列，例如HIV-1的PPT为AAAAGAAAAGGGGGG，可以抗RNase H降解，并作为第二股cDNA的引物。

3.逆转录过程 逆转录病毒感染宿主细胞时脱去包膜（成为宿主细胞膜的一部分），其由基因组RNA、tRNA引物和逆转录酶、整合酶、蛋白酶等组成的核衣壳进入细胞质，逆转录酶以基因组RNA为模板逆转录合成其前病毒DNA。合成过程包括逆转录——以病毒基因组RNA为模板合成单链互补DNA，降解——水解RNA-DNA杂交体中的RNA，复制——以单链互补DNA为模板合成双链互补DNA（即前病毒DNA）等环节（图2-47）。

前病毒DNA合成后进入细胞核，由整合酶（integrase，在序列、结构和功能上与转座酶有关）催化整合至染色体DNA中并处于休眠状态。整合位点虽然不具有特异性，但也并非完全随机。整合机制与细菌转座子简单转座类似，整合后在两端形成4～6bp的同向重复序列。前病毒DNA仅在整合状态下且被激活时才能转录，进而复制新病毒，因此整合是逆转录病毒生命周期中的重要事件。

4.逆转录意义 ①逆转录机制的阐明完善了中心法则。遗传物质不都是DNA，也可以是RNA。因为许多RNA还直接参与代谢，具有功能多样性（表1-3，17页），所以越来越多的学者认为在生命起源史上RNA可能是先于DNA出现的生命物质。②研究逆转录病毒有助于阐明肿瘤发生的机制，探索其治疗策略。已知的致癌RNA病毒均为逆转录病毒，大多数逆转录病毒不会杀死其宿主细胞，而是将其基因组整合于宿主DNA，随宿主细胞分裂而复制。通过研究其生命周期中的感染、逆转录、整合、表达、包装等环节的代谢机制，可以选择关键环节作为药物靶点，有针对性地发现药物。③逆转录酶是重组DNA技术常用的工具酶，可用于合成cDNA，进而制备cDNA探针、克隆细胞基因、构建cDNA文库等（表14-3，332页）。常用的是来自禽成髓细胞瘤病毒（AMV）和莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV）的逆转录酶及其重组体。④经过改造的逆转录病毒是重组DNA技术、转基因技术、基因治疗的常用载体。