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第七节
DNA的逆转录合成

逆转录 (反转录,reverse transcription)是以RNA为模板,以dNTP为原料,由逆转录酶催化合成DNA的过程。这是一个从RNA向DNA传递遗传信息的过程,与转录时从DNA向RNA传递遗传信息的方向相反,所以称为逆转录。逆转录病毒以RNA为遗传物质,复制时必须先由其RNA基因组指导合成DNA。

1.逆转录酶 1962年,H. Temin提出RNA病毒可能存在逆转录酶。1970年,D. Baltimore和H. Temin(1975年诺贝尔生理学或医学奖获得者)报道致癌RNA病毒携带逆转录酶,能以RNA为模板指导DNA合成,所以这类病毒又称 逆转录病毒 (retrovirus)。

逆转录病毒有以下四个特征:①是唯一的二倍体病毒。②是唯一完全利用宿主细胞的转录系统合成基因组的RNA病毒。③是唯一以宿主细胞特定RNA(tRNA)为引物进行复制的病毒。④是唯一在感染之后不能直接指导蛋白质合成的正链RNA病毒(第三章,95页)。

逆转录病毒的逆转录由逆转录酶催化进行。其 逆转录酶 (reverse transcriptase)又称依赖于RNA的DNA聚合酶(RDDP),有两个活性中心,催化三个反应。

(1)聚合酶活性中心:由一级结构前2/3构成,以两个Mg 2+ 为辅助因子,催化两个反应。①逆转录:以逆转录病毒基因组RNA为模板,逆转录合成 单链互补DNA (sscDNA),形成RNA-DNA杂交体。该合成反应需要引物提供3'-羟基,该引物是逆转录病毒颗粒自带的一种tRNA。②复制:以游离的单链互补DNA为模板,复制合成 双链互补DNA (dscDNA)。单链互补DNA和双链互补DNA统称 互补DNA (cDNA)。

一个逆转录病毒颗粒可以携带50~100个不同种类的tRNA分子,它们是在包装病毒颗粒时从宿主细胞获得的。不同的逆转录病毒以不同的tRNA作为引物。例如HIV-1的引物是tRNA Lys ,莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV,M-MuLV)的引物是tRNA Pro

(2)核糖核酸酶H活性中心:由一级结构后1/3构成,以两个Mg 2+ 为辅助因子,催化RNA-DNA杂交体中的RNA降解(所以命名为RNase H、核糖核酸酶H;H:hybridation),得到游离的单链互补DNA。

逆转录酶的聚合酶活性中心没有3'→5'外切酶活性和5'→3'外切酶活性,所以在逆转录合成DNA过程中不能校对,错配率较高(2×10 -4 ,在体外高浓度dNTP和Mg 2+ 下,错配率高达2×10 -3 ),因而逆转录病毒突变率高,容易形成新病毒株。

逆转录酶在体外可用于逆转录各种RNA,在宿主细胞内只能逆转录逆转录病毒自己的基因组RNA。

(3)逆转录酶抑制剂:①恩曲他滨属于全身用抗病毒药(XJ05),既是核苷及核苷酸类逆转录酶抑制剂(XJ05AF),又是艾滋病病毒感染的抗病毒药物(XJ05AR),通过抑制逆转录酶抑制HIV复制,还可联合替诺福韦(XJ05AF)抑制HBV复制。②齐多夫定(XJ05AF,XJ05AR)是脱氧胸苷类似物,是第一种被批准临床应用的抗艾滋病药物,被T细胞摄取后转化为三磷酸酯,与HIV逆转录酶亲和力大于dTTP,因而竞争性抑制dTTP结合。此外,齐多夫定无3'-羟基,因此连接至HIV-DNA的3'端致使其合成流产。

齐多夫定与细胞DNA聚合酶亲和力弱于dTTP,1~5μmol/L浓度下只影响逆转录,不影响细胞DNA复制,故对多数细胞无毒,但对骨髓细胞有毒性,因而会令患者出现贫血。

2.逆转录病毒基因组 逆转录酶是逆转录病毒基因组的表达产物。逆转录病毒基因组是mRNA,含5'帽子结构和poly(A)尾(第三章,87页)。其指导合成的双链互补DNA称为前病毒(provirus)。前病毒可以整合到宿主染色体DNA中,随之复制和表达,一定条件下可诱导宿主细胞癌变,因此逆转录病毒又称致癌RNA病毒。人类免疫缺陷病毒(HIV)属于逆转录病毒,是艾滋病的病原体。

各种逆转录病毒虽然大小不同,但是结构相似,都含有两个相同的正链基因组RNA拷贝(长度约为10000nt),其编码序列中含调控元件(图2-46)。

图2-46 Rous肉瘤病毒基因组

(1) 翻译区 (ORF):典型的逆转录病毒基因组包含以下3个基因:① gag ——编码一种基质蛋白和三种衣壳蛋白。② pol ——编码蛋白酶PR、逆转录酶RT和整合酶IN。③ env ——编码两种包膜蛋白,包膜蛋白赋予病毒感染性和宿主特异性。此外,有些逆转录病毒基因组还携带癌基因,例如Rous肉瘤病毒(劳斯肉瘤病毒,RSV)基因组携带癌基因 src

(2) 包装信号 (packaging signal):又称包装元件,为包装病毒颗粒所必需。

(3) 长末端重复序列 (LTR):为前病毒整合及转录所必需。完整的长末端重复序列长250~ 1400bp,包括以下序列:①U3——3'非翻译区(3' UTR,170~1260nt,含启动子、增强子)。②R——重复序列(10~97nt,含加尾信号,且参与整合)。③U5——5'非翻译区(5' UTR,80~100nt)。仅前病毒DNA的长末端重复序列(LTR)是完整的,且两端存在短反向重复序列(即U5的3'端与U3的5'端存在短反向重复序列)。

(4) 引物结合位点 (PBS):为逆转录所必需。PBS位于5' UTR下游,距离5'端100~200nt,可与tRNA引物3'端的18nt配对。

(5) 多嘌呤序列 (PPT):为复制所必需。PPT与U3相邻,富含嘌呤序列,例如HIV-1的PPT为AAAAGAAAAGGGGGG,可以抗RNase H降解,并作为第二股cDNA的引物。

3.逆转录过程 逆转录病毒感染宿主细胞时脱去包膜(成为宿主细胞膜的一部分),其由基因组RNA、tRNA引物和逆转录酶、整合酶、蛋白酶等组成的核衣壳进入细胞质,逆转录酶以基因组RNA为模板逆转录合成其前病毒DNA。合成过程包括逆转录——以病毒基因组RNA为模板合成单链互补DNA,降解——水解RNA-DNA杂交体中的RNA,复制——以单链互补DNA为模板合成双链互补DNA(即前病毒DNA)等环节(图2-47)。

前病毒DNA合成后进入细胞核,由整合酶(integrase,在序列、结构和功能上与转座酶有关)催化整合至染色体DNA中并处于休眠状态。整合位点虽然不具有特异性,但也并非完全随机。整合机制与细菌转座子简单转座类似,整合后在两端形成4~6bp的同向重复序列。前病毒DNA仅在整合状态下且被激活时才能转录,进而复制新病毒,因此整合是逆转录病毒生命周期中的重要事件。

4.逆转录意义 ①逆转录机制的阐明完善了中心法则。遗传物质不都是DNA,也可以是RNA。因为许多RNA还直接参与代谢,具有功能多样性(表1-3,17页),所以越来越多的学者认为在生命起源史上RNA可能是先于DNA出现的生命物质。②研究逆转录病毒有助于阐明肿瘤发生的机制,探索其治疗策略。已知的致癌RNA病毒均为逆转录病毒,大多数逆转录病毒不会杀死其宿主细胞,而是将其基因组整合于宿主DNA,随宿主细胞分裂而复制。通过研究其生命周期中的感染、逆转录、整合、表达、包装等环节的代谢机制,可以选择关键环节作为药物靶点,有针对性地发现药物。③逆转录酶是重组DNA技术常用的工具酶,可用于合成cDNA,进而制备cDNA探针、克隆细胞基因、构建cDNA文库等(表14-3,332页)。常用的是来自禽成髓细胞瘤病毒(AMV)和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)的逆转录酶及其重组体。④经过改造的逆转录病毒是重组DNA技术、转基因技术、基因治疗的常用载体。

图2-47 前病毒DNA合成过程 QdPtEuXstMUWrcDbk/0jB5nbuFgw5rv8YGuv0rG8RqL5dhmR1qHP90vYJKy/KEcM

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