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真核生物染色体DNA在细胞周期S期复制，复制机制与大肠杆菌相似，但复制过程更为复杂。真核生物线粒体DNA复制机制称为D环复制。
真核生物染色体DNA与组蛋白、非组蛋白、RNA形成线性染色质结构，位于细胞核内，其复制有别于原核生物，复制系统也比原核生物复杂。染色体DNA的端粒通过特殊机制合成。
真核生物的基因组比原核生物大，且形成复杂的染色体结构。例如人类为3000Mb，而大肠杆菌只有4.6Mb。不过，真核生物染色体DNA的复制用时并不长，且有以下特点。
1.全部染色体同步复制 且与细胞周期同步，每个细胞周期只复制一次。
2.发生染色质解离与重塑 真核生物的染色体DNA与组蛋白形成核小体结构，复制叉经过时需短暂解离；而当复制叉经过之后，还要马上在两条子代DNA双链上重塑核小体结构。相比之下，原核生物的DNA是裸露的，复制叉在推进过程中少有阻碍，所以复制速度较快。
3.复制速度慢 受染色质解离与重塑影响，真核生物染色体DNA复制叉的推进速度约为50nt/s，仅为大肠杆菌DNA复制叉推进速度（800～1000nt/s）的1/16～1/20。
4.多起点复制 复制起点不含核小体结构。①真核生物的染色体DNA是多复制子DNA，每个复制子都比较短，为30（酵母）～300kb（动物）。例如，酿酒酵母染色体DNA有400多个复制起点（称为自主复制序列，ARS，复制因子，replicator，长约150bp），复制子平均长度为30kb；人类全部染色体DNA可能有3×10 4 ～5×10 4 个复制起点，复制子平均长度为100kb，仅相当于大肠杆菌的2%。②基因组中复制子长度差异大，可相差10多倍。③如果各复制子同时启动复制，哺乳动物DNA复制完成约需1小时，但实际上需要6～10小时，因此只有15%复制子同时启动复制。通常靠近常染色质或活性基因的复制子先启动复制。当然也有各复制子同时启动复制的。复制起点组没有特异性。④大多数复制子没有终止区。
5.冈崎片段短 真核生物冈崎片段的长度为100～200nt，而大肠杆菌冈崎片段的长度为1000～2000nt。
6. DNA连接酶耗能差异 真核生物DNA连接酶连接冈崎片段时由ATP供能，而大肠杆菌由NAD + 供能。
7.终止阶段涉及端粒合成 真核生物的染色体DNA为线性结构，其末端端粒通过特殊机制合成。
8.受DNA复制检查点控制 从而使染色体DNA在一个细胞周期中只复制一次；而快速生长的大肠杆菌分裂一次仅需18分钟，其DNA在一轮复制完成之前即可启动下一轮复制（“胎中胎”）。
真核生物有十几种DNA聚合酶，其基本性质和大肠杆菌DNA聚合酶一致，都有5'→3'聚合酶活性。真核生物染色体DNA复制主要由三种多亚基酶催化，DNA聚合酶α、ε、δ分别催化合成引物、前导链、后随链。线粒体DNA由DNA聚合酶γ催化复制。
1. DNA聚合酶α 又称αDNA聚合酶-引物酶复合物，功能是催化合成引物。
人DNA聚合酶α为异四聚体，含聚合酶催化亚基POLA1和调节亚基POLA2，引物酶催化亚基PRIM1和调节亚基PRIM2。染色体DNA复制时，先由引物酶催化亚基PRIM1催化合成RNA引物（约10nt），再由聚合酶催化亚基POLA1催化合成一段DNA（10～30nt），随后发生聚合酶转换（polymerase switching），即由DNA聚合酶δ、ε接替DNA聚合酶α催化DNA延伸合成。POLA1没有3'→5'外切酶活性，故无校对活性。
2. DNA聚合酶ε 功能是催化合成染色体DNA前导链。此外联合DNA聚合酶κ参与核苷酸切除修复。
人DNA聚合酶ε为四聚体结构，由催化亚基POLE1和辅助亚基POLE2、3、4组成。
3. DNA聚合酶δ 功能是催化合成染色体DNA后随链。此外联合DNA聚合酶κ负责约50%的核苷酸切除修复，参与部分跨损伤合成。
人DNA聚合酶δ为四聚体结构，由催化亚基POLD1和辅助亚基POLD2、3、4组成，催化亚基含5'→3'聚合酶活性中心（切口平移）、3'→5'外切酶活性中心（校对）。
4. DNA聚合酶γ 是线粒体唯一的DNA聚合酶，负责mtDNA的复制与修复。
人DNA聚合酶γ为三聚体结构，由一个催化亚基POLG1和两个辅助亚基POLG2组成。
参与真核生物染色体DNA复制的因子种类比原核生物多，结构和功能也更复杂。以下为已阐明的参与人类染色体DNA复制的因子。
1.起始识别复合物（ORC） 与大肠杆菌DnaA同源，是一种六亚基蛋白质（ORC1～ ORC6），在复制起始阶段与染色体DNA复制起点的保守序列结合，启动组装复制前复合物（pre-RC）。ORC在整个细胞周期中都结合于复制起点，并且受控于调节细胞周期的一组蛋白质。
2.细胞分裂周期蛋白6（CDC6）和DNA复制因子1（CDT1） 参与复制起始。CDC6与ORC1结合促进DNA解旋酶MCM组装，并介导其与复制起点结合，从而组装复制前复合物。CDT1协助CDC6促进解旋酶MCM组装。
3.解链、解旋酶类 包括DNA解旋酶MCM、解旋酶hDNA2、DNA拓扑异构酶和复制蛋白A。
（1）解旋酶MCM：是由6种微小染色体维持蛋白（minichromosome maintenance protein，MCM蛋白，MCM2～MCM7）构成的六聚体环状MCM2-7复合物，相当于大肠杆菌的解旋酶DnaB，但是沿前导链模板3'→5'方向解链。细胞内缺少任何一种MCM都会导致DNA复制无法启动，故MCM与CDC6、CDT1统称DNA复制许可因子（replication licensing factor，RLF）。
（2）解旋酶hDNA2：有ATPase活性、DNA解旋酶活性和核酸内切酶活性，参与染色体DNA和线粒体DNA复制和修复。①冈崎片段5'端切除序列（flap）如果过长（超过27nt），会被复制蛋白A（RPA）包被而抗侧翼核酸内切酶1（flap endonuclease 1，FEN-1）切割，则先由hDNA2切短，使RPA不能结合，再被FEN-1切割。②在修复双链断裂时削平5'端。
（3）DNA拓扑异构酶：真核生物DNA拓扑异构酶分为Ⅰ型和Ⅱ型，功能和作用机制与原核生物相似，但有以下区别：①真核生物Ⅰ型和Ⅱ型DNA拓扑异构酶均可松弛负超螺旋和正超螺旋，原核生物仅可松弛负超螺旋。②真核生物细胞核Ⅰ型DNA拓扑异构酶包括DNA拓扑异构酶1、3α和3β，Ⅱ型DNA拓扑异构酶包括DNA拓扑异构酶2α和2β。此外还有线粒体Ⅰ型DNA拓扑异构酶。③真核生物DNA拓扑异构酶1和线粒体Ⅰ型DNA拓扑异构酶催化反应时，活性中心酪氨酸羟基是取代5'-羟基与3'-磷酸基结合形成切口，5'-羟基游离。原核生物及真核生物其他DNA拓扑异构酶活性中心酪氨酸羟基是取代3'-羟基与5'-磷酸基结合形成切口，3'-羟基游离。④真核生物DNA拓扑异构酶3α还参与染色体分离、同源重组和线粒体DNA连环体解离。⑤真核生物Ⅱ型DNA拓扑异构酶是染色体蛋白中含量最多的蛋白质之一，对维持染色质结构非常重要。
如果没有DNA拓扑异构酶，DNA既不能复制、转录，也不能组装染色质，因而其抑制剂可以杀死细胞。肿瘤细胞拓扑异构酶高表达，拓扑异构酶抑制剂对其毒性高于正常细胞，可用于肿瘤化疗。已有Ⅰ型、Ⅱ型DNA拓扑异构酶抑制剂类抗肿瘤药物。
● 拓扑异构酶抑制剂：①喜树碱衍生物伊立替康、拓泊替康（XL01CB，药品目录误为鬼臼毒素衍生物）及羟喜树碱（XL01CX）为抗肿瘤药物，作用机制是与Ⅰ型拓扑异构酶-DNA复合物结合，抑制切口连接。②蒽环类衍生物多柔比星（又称阿霉素，XL01DB）、鬼臼毒素衍生物依托泊苷（XL01CB）为抗肿瘤药物，作用机制是与Ⅱ型拓扑异构酶-DNA复合物结合，抑制切口连接。
（4）复制蛋白A（RPA）：结合并保护单链DNA，类似于大肠杆菌的单链DNA结合蛋白（SSB）。目前已在人体内鉴定了cRPA（由RPA1、2、3亚基构成）和aRPA（由RPA1、3、4亚基构成）两种异三聚体，以cRPA为主。它们在DNA复制、重组和修复过程起作用。
4.复制因子C（RFC） 又称激活蛋白1（activator 1），是PCNA的夹子装置器，促进复制复合物组装，人体RFC为RFC1～RFC5异五聚体，相当于大肠杆菌γ复合物，RFC1与引物-模板杂交区结合，RFC2与ATP结合。在复制延伸阶段接替DNA聚合酶α与引物3'端结合，并与增殖细胞核抗原（PCNA）一起协助DNA聚合酶δ或ε与DNA模板结合（消耗ATP），形成复制体，催化DNA延伸合成。
5.增殖细胞核抗原（PCNA） 在增殖细胞的细胞核内大量存在，有同三聚体结构，由RFC募集并与DNA结合，功能是提高DNA聚合酶δ、ε与DNA模板的亲和力，从而增强其延伸能力，与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ的β夹子（β 2 ）同源。
6.核糖核酸酶H2（RNase H2）和侧翼核酸内切酶1（FEN- 1） ①RNase H2是由A、B、C亚基构成的异三聚体，其中A为催化亚基，可以降解RNA-DNA杂交体中的RNA，在DNA复制过程中降解冈崎片段的引物RNA。②FEN-1（flap endonuclease 1）又称DNase Ⅳ，有5'侧翼内切酶和5'→3'外切酶活性，三分子FEN-1与PCNA同三聚体形成六聚体，参与DNA复制（引物切除）和损伤修复。
7. DNA连接酶 包括DNA连接酶1、3、4，均消耗ATP，参与DNA复制、重组、修复。
真核生物染色体DNA的复制起点又称 自主复制序列 （autonomously replicating sequence，ARS）。
1.复制起点结构 作为最简单的真核生物，酿酒酵母基因组ARS目前研究得最清楚，其16条染色体中约有400个ARS，每个ARS长50～185bp，含4段保守序列，从3'到5'依次为A、B1、B2、B3，其中A序列长14～15bp，包含一段富含AT的11bp共有序列A/TTTTATRTTTA/T，称为 复制起点识别元件 （origin recognition element，ORE），是起始识别复合物（ORC）的结合位点。ORE紧邻一段约80bp的富含AT序列，是DNA解旋元件（DUE）、DNA解旋酶MCM的结合位点。哺乳动物ARS结构特征有待阐明。
2.复制起始机制 酵母DNA复制起始过程分两个阶段。
（1）组装复制前复合物：在细胞周期G 1 期，ORC识别并结合于ARS中的A序列和B1序列，ORC募集CDC6、CDT1，三者共同募集解旋酶MCM，组装成 复制前复合物 （pre-RC）。
（2）启动DNA复制：进入S期后，周期蛋白依赖性激酶复合物cyclin A-CDK2催化CDC6、CDT1等磷酸化，Dbf4依赖性激酶（DDK，Cdc7-Dbf4二聚体）催化解旋酶MCM磷酸化，RPA、DNA聚合酶δ/ε、DNA聚合酶α、RFC、PCNA依次结合，启动DNA复制。之后CDC6、CDT1被释放和降解（CDC6半衰期不到5分钟），避免启动二次复制。
真核线性染色体DNA复制终止发生于相邻复制起点的两个相向复制叉会合时。与大肠杆菌类似，终止过程包括复制体解离、连环体解离，需要其他蛋白质参与，细节有待阐明。
与原核生物DNA复制终止的显著区别是真核生物DNA复制终止涉及端粒合成。
1971年，A. Olovnikov提出末端复制问题（end replication problem）：既然真核生物的染色体DNA为线性结构，那么在复制时，后随链5'端切除RNA引物之后会留下短缺，无法由DNA聚合酶催化补齐。如果任其存在，DNA每复制一次，DNA双链都会缩短一部分（100bp甚至更多，图2-21）。
图2-21 染色体DNA复制时末端短缺
1978年，E. Blackburn发现真核生物线性DNA末端存在端粒结构；1980年，E. Blackburn和J. Szostak报道其作用；1984年，C. Greider（在读研究生）发现了端粒酶。E. Blackburn、C. Greider和J. Szostak因发现端粒和端粒酶并阐明其对染色体DNA的保护作用而获得2009年诺贝尔生理学或医学奖。
1.端粒结构 端粒 （telomere）是一种短串联重复序列，人端粒新生链（后随链，CA股）重复单位是CCCTAA，模板（TG股）重复单位是TTAGGG。复制后端粒的TG股长出，所以形成3'端突出结构。
2.端粒功能 端粒的功能是维持染色体结构的独立性和稳定性，从而在染色体DNA复制和末端保护、染色体定位、细胞寿命维持等方面起作用。①末端保护：防止DNA被修复系统降解。②延伸合成：防止DNA因复制而缩短。③参与同源染色体配对和重组：促进减数分裂。
研究表明，体细胞染色体DNA的端粒会随着细胞分裂而缩短。当端粒缩短到一定程度时，细胞会停止分裂。因此，端粒起细胞分裂计数器的作用，其长度能反映细胞分裂的次数。
3.端粒酶 端粒是由端粒酶催化合成的。 端粒酶 （telomerase）的化学本质是含有一段RNA的核糖核蛋白。人端粒酶RNA长451nt，含CUAACCCUAAC序列，可以作为模板指导合成其端粒的TG股。因此，端粒酶是一种自带RNA模板的特殊逆转录酶。
4.端粒合成 ①端粒酶结合于端粒TG股3'端，以端粒酶RNA为模板，催化合成端粒TG股一个重复单位。②端粒酶前移一个重复单位。③重复合成重复单位、前移（图2-22）。TG股合成到一定长度时（人3～20kb，控制机制尚未阐明），端粒酶脱离。TG股募集引物酶、DNA聚合酶等，合成冈崎片段填补CA股短缺。虽然端粒依然保持3'端突出结构，但最终可以形成 t环 （t-loop，图2-23），由端粒结合蛋白（如人的TRF1、TRF2）进一步结合并保护。
图2-22 端粒合成
图2-23 端粒t环结构
端粒的长度反映端粒酶的活性。端粒酶分布广泛，在生殖细胞、胚胎细胞、干细胞和85%～90%的肿瘤细胞（如Hela细胞）等快速增殖的细胞中活性较高，这些细胞染色体DNA的端粒也一直保持一定长度；而其他体细胞中端粒酶活性很低，其染色体DNA的端粒随着细胞分裂进行性缩短，成为导致某些器官功能减退的原因之一。
5.端粒酶与肿瘤诊断 神经母细胞瘤是一种来源于未分化的交感神经节细胞的胚胎性神经内分泌肿瘤，可通过分析端粒酶活性进行诊断。其预后与端粒酶活性呈负相关，即端粒酶活性越高预后越差。端粒酶基因表达受N-myc蛋白激活，故其水平也可以反映治疗效果， MYCN 基因发生扩增的肿瘤患者预后差。
6.端粒酶与肿瘤治疗 多数肿瘤细胞端粒酶活性很高，多数正常细胞端粒酶活性很低，因而端粒酶有望成为抗肿瘤药物靶点。
绝大多数mtDNA为共价闭合环状结构，且H链和L链的复制起点错位分布，相隔距离为mtDNA总长度的1/3。mtDNA由DNA聚合酶γ催化复制，在细胞分裂S期和G 2 期进行。
1. H链复制合成 从其亲代L链上的复制起点 ori H 处解链，RNA聚合酶催化转录合成RNA，RNA被特异核酸内切酶切割成引物，引导DNA聚合酶γ合成新生H链，并且是单向复制。
2. L链复制合成 当新生H链合成达到mtDNA总长度的2/3时，亲代H链上的复制起点 ori L 暴露，由特定引物酶合成RNA引物，引导DNA聚合酶γ合成新生L链（图2-24）。
图2-24 线粒体DNA的D环复制
mtDNA两股链的复制起点错位分布，两股链复制的起始时间不同，终止时间也不同，所以其复制是不对称的。这种复制的前期是以新生H链替换（displacement）亲代H链的过程，并且亲代H链的游离结构形似字母D，所以这种复制被形象地称为 D环复制 （D-loop replication）。
叶绿体DNA的复制方式也是D环复制，高等植物叶绿体DNA有两个D环。