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四、肠道菌群领域的相关研究

在大量研究的基础上,人们开始认识到人体健康与疾病诊疗始终与肠道菌群相关。从目前所报道的研究结果来看,肠道菌群对人体健康的影响远超过人们最初的预想。肠道菌群参与了人体出生至衰亡的整个生命代谢过程,因此应该在临床诊疗中将肠道菌群作为一项重要的健康指标,并将其纳入辅助医疗的重要课题加以深入研究。饮食对于人体健康的重要性不言而喻,而肠道菌群则是联系饮食和人体健康的桥梁。饮食的改变可以影响肠道菌群的组成、结构和功能,而肠道菌群通过调节肠道中营养物质的代谢又影响着人体的生理状态。因此,通过膳食干预的方法为肠道菌群的调控和重构提供了新的方向和思路。研究发现,通过膳食补充益生菌可调节机体肠道菌群的结构,影响肠道菌群的新陈代谢,并进而影响人体的健康。以糖尿病、心脑血管疾病、痛风等代谢相关疾病,以及感染性肠胃炎、肠易激综合征、肝硬化等疾病发病相关的代谢机理与疾病预警模型为研究对象,已取得进展并开始应用于临床治疗中。益生菌作为主要调节肠道菌群的干预措施,目前在疾病中的研究十分火热,并已取得阶段性成果。

(一)肝肠循环、脑-肠轴、肠-肾轴和肠-脑-皮轴

肠道菌群不但与肠道疾病有关,还与代谢疾病、肝脏疾病、免疫疾病,甚至神经类疾病相关联。许多研究和实践证明肠道健康与全身有关,是因为人体存在着肝肠循环、脑-肠轴、肠-肾轴和肠-脑-皮轴等机制。

(1)肝肠循环。肝肠循环原指经胆汁或部分经胆汁排入肠道的药物,在肠道中又重新被吸收,经门静脉又返回肝脏的现象。在研究药物的药效时发现,一些药物、内源性物质和有毒物质等经肝转化,会以代谢物或以原形分泌进入胆汁,经胆总管排入十二指肠,其中一部分被小肠重吸收,由门静脉回流入肝,然后再经胆汁排入肠腔,如此往复就形成肝肠循环。肝肠循环的存在,可使有限的胆汁酸重复利用,促进脂类的消化与吸收。肝肠循环在药效学上表现为药物的作用时间延长,如果该药物的肝肠循环被阻断,则会加速该药物的排泄。肠道菌群研究发现,正常情况下肝脏能降解来自肠道的各种毒素、细菌、真菌等。但当肝脏发生疾病时,通过肝肠循环,会使肠道微生态发生显著变化,肠黏膜屏障功能受损,会使肠道通透性增加,肠道菌群及代谢产物大量通过门静脉系统进入肝脏,激活肝脏的非特异性免疫系统,产生大量的炎性细胞因子和趋化因子,引起或加重肝脏的炎症反应,甚至导致肝硬化、肝癌的发生。鉴于肠道菌群在肝脏疾病中的特殊作用,服用适当的益生菌已成为治疗肝脏疾病的新途径。

(2)脑-肠轴。许多研究表明,脑、肠之间存在着一个复杂的神经-内分泌网络,这个网络将脑与胃肠道联系在一起,故被称为脑-肠轴。脑-肠轴是中枢神经系统与胃肠道功能相互作用的双向调节轴,是联络中枢神经系统、肠神经系统、神经内分泌和免疫系统的双向作用通路。在神经传导方面,胃肠道是由中枢神经系统、肠神经系统和自主神经系统共同支配的。肠神经系统既能接受中枢神经系统的调节和控制,同时也具有独立整合信息的功能,其所包括的肌间神经丛和黏膜下神经丛在整个消化道壁内分布广泛、联系密切,故又有“肠脑”之称。肠道菌群通过脑-肠轴与大脑可以进行脑肠互动。一方面由大脑通过神经传导和内分泌调节,对胃肠道正常的消化、吸收过程进行调节,大脑产生的信号能够影响肠道菌群的构成;另一方面肠道菌群不仅影响肠道活动,还影响宿主的脑功能和行为,肠道菌群分泌的化学物质又能够反过来塑造大脑的结构。人类肠道中有着庞大的神经网络,直接与大脑相通。肠道中的神经元大约有1亿个,这也是肠道又被称为“第二大脑”的原因。除神经传导以外,脑与胃肠之间还存在着内分泌激素调节,而这种调节主要是通过脑肠肽来实现的。肠神经系统能合成和释放多种脑肠肽,并将信息传递、整合至高级神经系统。肠道菌群对人体健康的重要作用已体现在全身性的慢性炎症及代谢系统相关疾病中,它们还通过脑-肠轴操控着人体的神经系统与各器官的健康状态。

功能性胃肠病是缺乏器质性病变或其他证据的一组疾病,患者具有腹痛、腹胀、腹泻及便秘等消化系统症状,并常表现为焦虑、抑郁等,严重影响患者的生活质量。脑肠互动异常是功能性胃肠病潜在的发病机制之一。其病理、生理机制是脑-肠轴双向通路发生功能障碍;肠道黏膜免疫反应参与机体的免疫和炎症反应的调控,炎症信号可通过体液、神经系统等传递入脑,进而对身体机能的调控产生影响。如今我们都知道情绪影响胃部功能,这或许是大脑和胃肠道系统之间沟通交流所致。人类肠道菌群也是大脑-肠道交流过程的重要参与者,这种关联使研究人员开始利用“沟通疗法”和抗抑郁药物来治疗患者的一些慢性肠道问题,其主要目的就是通过修复大脑对肠道的错误指令,干扰两个器官之间的交流。“沟通疗法”能够帮助改善抑郁症,并且改善胃肠道疾病患者的生活质量,而抗抑郁药物对患者的肠道疾病及其所伴随的焦虑及抑郁症状均有有益的效果。

肠道中分布有大量淋巴细胞,免疫系统又与中枢神经系统密切相关,因而肠道菌群可通过血脑屏障、细胞对外界信息的感受器(Toll样受体)和IL-1来调节脑的活动和功能。

研究发现,肠道细菌和大脑代谢物之间是通过一种名为皮质醇的化合物来实现沟通的。这种沟通途径的发现提供了一种解释自闭症特征的潜在机制,同时为开展用益生菌配合治疗精神心理疾病的研究提供了理论基础。肠道菌群能够调节大脑的功能以及行为。平衡的肠道菌群可以促进一个人的身心健康,而肠道菌群失调则可能引发肠-脑疾病(如肠易激综合征、炎性肠道疾病和肝性脑病等)和中枢神经系统疾病(如多发性硬化症、阿尔兹海默症、帕金森病和自闭症等)。有研究报道,肠道菌群紊乱,是导致抑郁症、帕金森病等心脑疾病的罪魁祸首。深入了解肠道菌群对一个人行为的影响,有助于人们更好地理解肠易激综合征和多发性硬化症等的发病机理,明确调节和恢复正常肠道菌群的安全有效措施(补充益生菌)是治疗精神心理疾病的重要组成部分。

中医强调整体观念,并十分重视藏象理论,虽未正式提出脑-肠轴理论,但也将此应用于临床,尤其是在脏腑经络的辨证体系当中,应用更为广泛。因此,从脑-肠轴途径来探讨胃肠道疾病,具有非常大的指导意义和临床实用价值。

(3)肠-肾轴。它是指胃肠道与肾脏相互作用,胃肠道与肾脏任何一方发生变化都会通过能量物质代谢、免疫反应、肠黏膜和肠道菌群变化等影响另一方,并可互为因果。总之,肠道、肾之间可以通过代谢和免疫两种路径构成肠-肾轴而相互影响。肠-肾轴理论的产生受“肠肾综合征”概念的启发,此概念首次于2011年的国际透析大会上提出,其有力地证明了肠、肾之间在病理、生理上存在着密切的关系。有研究发现,血透患者因血液在透析机内的暂时“集聚”使有效血容量呈一过性下降,导致肠黏膜出现缺血-再灌注损伤,使其屏障作用受到多种理化因素的冲击而遭到破坏,继发内毒素入血致病,出现心、脑、肾等多个脏器的病变。肠-肾轴理论简而言之就是:肠道功能损伤影响肾脏,肾脏疾病影响肠道功能;肠、肾病变相互作用影响全身。基于肠-肾轴理论的上述研究,使得诸多以肠道为切入点治疗慢性肾脏病的方法应运而生,事实证明也确有疗效。

(4)肠-脑-皮轴(肠道-大脑-皮肤轴)。患有心理和精神疾病的人群同时患有皮肤问题的比例非常高,通过检测肠道菌群的组成发现,这些患者的肠道菌群的构成与健康人存在明显不同。在实施了针对肠道菌群的干预措施后,随着肠道菌群良好状态的恢复,患者的精神状态和皮肤症状均会随之改善。科学家将肠道状态、肠道菌群以及心理疾病与皮肤疾病的关联称作肠道-大脑-皮肤轴。肠道菌群可影响皮肤疾病的发生,并且精神状态与肠道菌群状况可反映皮肤健康状况;反之,皮肤状况也可作为精神状态和肠道菌群状况的评估参照。从肠道菌群的角度分析了皮肤病的发病机理,围绕肠-脑-皮轴来寻找皮肤病的发病原因,并以此进行皮肤疾病的预防和干预,或许将成为治疗此类疾病的重要方向。

饮食也可通过肠-脑-皮轴影响皮肤。不当饮食可直接引起痤疮。服用乳杆菌可抑制由压力引起的皮肤炎症。益生菌具有改善肠道屏障功能、恢复肠道微生态健康、刺激人体免疫系统和对抗炎症等作用,在皮肤疾病的防治方面有一定作用。

总之,肠道菌群、肠道、大脑和皮肤并不各自独立,而是相互密切关联的复合系统。未来皮肤病的治疗趋势将采取多种影响肠-脑-皮轴的干预措施,并综合运用饮食、益生菌、益生元、药物和心理干预等方式。肠-脑-皮轴的研究为皮肤和精神疾病提供了新颖而清晰的干预和治疗方向,具有重要的理论和应用价值。

(二)肠道微生态的检测方法

肠道微生态的检测内容主要包括肠道菌群的数量、种类和组成。在对疾病、个体肠道菌群差异分析的基础之上,通过检查肠道菌群组成的变化,我们可以预测某些疾病的发生并建立能够通过微生物诊断而进行疾病早期诊疗的方法,这是目前肠道菌群研究的热点问题。随着快速、方便的基因测序和多组学技术的出现,肠道菌群的组成和功能改变在许多慢性疾病发生发展中起到的作用日渐清晰。这有助于对疾病进行更好的诊断和治疗。目前报道的益生菌对肠道微生态环境的效应评估主要通过检测粪便中菌群的种类和数量,还有一些其他指标,包括粪便中相关酶的活性、短链脂肪酸的含量、内毒素浓度及肠道pH等。

(1)传统检测方法。传统的肠道菌群检测方法包括细菌的培养鉴定、显微镜观察和生化鉴定等,存在耗时长、要求高、成本高、影响因素多和敏感度低等问题。传统细菌培养法一般采用细菌培养、纯化分离、革兰氏染色、生化反应及血清学实验等方法对细菌进行鉴定,通过倍比稀释和菌落计数来测定活菌数量。在利用传统微生物技术对微生物菌群进行培养时,为了得到微生物纯培养,需要对目的菌株进行富集培养,这样不可避免地造成部分微生物的衰减,人为改变了原始菌群的微生态构成,使菌群结构的研究结果产生较大偏差。

(2)分子生物学技术的检测方法。随着分子生物学技术的发展和核糖体RNA(rRNA)研究的深入,发展出了很多快速、敏感和特异性的新检测方法,特别是近年来高通量测序技术的发展使某些原本难以被检测到的细菌已能被检测到。

目前用于肠道菌群研究的分子技术有rRNA/DNA序列分析、随机扩增多态性分析、温度梯度凝胶电泳、聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)等。其中PCR-DGGE是近年来国内外应用比较广泛的技术,是检测微生物多样性的一种有效方法。该方法首先提取出分析样品的细菌总DNA,然后根据16S rRNA基因中比较保守的碱基序列设计通用引物,用来扩增微生物群落基因组总DNA,再对扩增的混合聚合酶链式反应(PCR)产物进行变性梯度凝胶电泳。不同的核酸有不同的序列,大小相同但序列不同的DNA片段在进行变性梯度凝胶电泳时,将停留在凝胶的不同位置,从而混合PCR产物得以分离。电泳条带的数目和密度可分别反映细菌的种类数量和细菌的相对构成比例。如想鉴定细菌,可将某一单一条带切下回收、克隆测序,然后将所得序列与核酸序列数据库中的公开序列进行对比分析。PCR-DGGE技术在揭示复杂微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性,目前已成为分析微生物群落组成和动态变化的有力工具。

(3)宏基因组及宏基因组测序。宏基因组又称元基因组或微生物环境基因组。宏基因组测序是以特定环境样品中全部微生物DNA作为对象进行测序,以此提供广泛和复杂的微生物群落信息。宏基因组学技术的出现为肠道微生态的研究开辟了新的途径。该技术不同于以往对一个单独的标记基因或样品中一段DNA序列的测序,其涵盖了对样品中微生物群落所有菌种的分析,除了识别特异性菌株外,宏基因组测序还可以评估微生物能够发挥的功能。因此,该技术的应用不仅可加强对肠道微生态的认识,还可为探究生命和疾病的本质提供全新的视角。随着宏基因组数据的不断更新,研究人员发现利用粪便中的肠道微生物进行宏基因组标记可进行相关疾病如结直肠癌的早期诊断或癌症筛查,且通过PCR定量的特异性标志物可以对疾病状态进行分类,并通过基因标志物的水平预测患者的存活能力。该技术还为肠道菌群特别是部分益生菌的功能开发与应用奠定了基础。

(4)高通量测序技术。高通量测序技术又称下一代测序(NGS)技术,一次可对数十万到数百万条核酸分子进行测定,快速经济,每个样品可产生高达数百万的读数,缺点是读取长度非常短。三代测序技术是单分子测序技术,测序时无需经过PCR扩增,对每一条DNA分子单独测序。二代和三代测序技术在广度和深度上为宏基因组学研究带来了巨大的变革。近年来有人提出了第四代测序技术——固态纳米孔测序技术。高通量测序技术让全面深入分析复杂的肠道微生物成为可能。

(三)肠道微生态与中医证候的相关性

目前肠道微生态在中医药学领域的研究也颇受重视,关于肠道微生态与中医证候相关性的研究主要集中在脾虚证与肠道菌群的变化关系及健脾方剂对肠道微生态多样性和菌群组成的影响方面。

(1)脾虚证与肠道微生态。脾虚证是中医临床常见的一类证候,是慢性消化系统疾病的主要证型,具体包括脾气虚、脾阴虚、脾阳虚及脾虚兼证。脾主运化,脾虚机体的消化吸收功能出现障碍,表现为纳差、便溏、消瘦等症状,机体各脏器间的平衡遭到破坏,进而导致菌群失调,而肠道菌群的失调又会影响物质的营养代谢,进一步加重脾虚症状。近年的临床及动物实验已证实脾虚证与肠道菌群的变化密切相关。动物实验方面,番泻叶、大黄水煎液治疗所致的脾虚大鼠模型出现了肠道菌群多样性指数下降;大黄煎汁治疗所致的脾虚小鼠模型亦存在显著的微生态失调,肠道乳酸杆菌和双歧杆菌均有不同程度地下降。临床研究方面,对老年脾虚患者肠道菌群16S rDNA变性梯度凝胶电泳分析发现,脾肾阳虚、脾气虚和脾肾阳虚兼脾气虚患者的肠道菌群结构具有明显特征,并与临床诊断结果基本一致;同一证型不同病症、不同临床表征和不同病程的患者肠道菌群结构不同,此研究结果在一定程度上为同病异治提供了依据。证候变化的实质可能与肠道微生态的改变相关,例如,四君子汤能提高利血平所致脾虚大鼠肠道中益生菌的比例,增加肠道菌群的多样性;参苓白术散可改善大黄水煎液所致脾虚小鼠肠道菌群的失调情况。

(2)脾胃湿热证与肠道微生态。脾胃湿热证也是中医脾胃证候中的一个常见证候。研究发现,与健康人比较,腹泻型肠易激综合征脾胃湿热证患者的肠杆菌、肠球菌明显增多,双歧杆菌、乳杆菌、消化球菌明显减少,酵母菌、拟杆菌无明显改变;与脾虚证比较,脾胃湿热证患者肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌、消化球菌明显增多,而酵母菌无显著性差异。在溃疡性结肠炎脾胃湿热证的肠道微生态研究中也发现,脾胃湿热证与脾虚证患者相比,粪便中的双歧杆菌含量降低,大肠杆菌含量及肠道微生物定植抗力二者无差别。由此可见,脾胃湿热证同样存在肠道菌群的变化,而且其肠道菌群结构有别于脾虚证。

(3)肾阳虚证与肠道微生态。通过对比研究家族性肾阳虚患者与正常人的粪便标本,发现肾阳虚家系都出现较明显的肠道菌群失调,主要表现为有的家族肠球菌、大肠杆菌等肠道需氧菌显著增加,葡萄球菌也显著增加,双歧杆菌显著下降;有的家族乳酸杆菌显著下降。在肾阳虚家族之中,需氧菌与厌氧菌总数比值明显高于正常人,霉菌总数与不同患者的肠道菌群失调程度呈正相关。基于上述临床研究结果,肾阳虚证临床上常可兼见大便久泻不止、完谷不化、五更泄泻等症状,可能与肾阳虚导致肠道菌群失调影响了机体对食物腐熟运化的功能有关。 uTV8XOS87dKJY+Gr6dcUEnZcvyZuF7lu4BkAFqsQ5Ab+WG3H7gWDBqUequJJrGrf

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