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1925 年初，久困在广东各地的军阀开始蠢蠢欲动，妄图夺取广东政权。为首的是盘踞在广东东江流域的陈炯明。
陈炯明早年追随过孙中山，是孙中山倚重的一支武装力量。1922年，陈炯明发动武装叛乱，炮轰总统府，使孙中山彻底打碎了对旧军阀势力的幻想。
不久，陈炯明被孙中山赶出广州，逃往东江流域。他一直伺机反扑。孙中山北上后，陈炯明认为时机成熟了，他自称救粤军总司令，依靠英帝国主义的势力，勾结南北军阀进犯广州。
广东革命政府面临的局势愈来愈紧张。
为保卫革命的胜利果实，广东政府决定趁陈炯明尚未举兵前，主动出击，东征讨陈。1月15 日，广东革命政府发动东征命令，决定由粤、桂、滇、湘、鄂、豫各军组成东征联军。部队分左、中、右三路作战：左路是滇军杨希闵部，约三万人，进攻目标是驻防河源、五华、兴宁县一带的陈炯明军林虎部；中路是桂军刘震寰部，约六千人，进攻目标是扼守惠州的陈炯明军杨坤如部；右路是粤军许崇智部，约一万人，进攻目标是陈炯明军嫡系洪兆麟部。消息传到黄埔军校，师生们沸腾了，纷纷请缨作战。
广东革命政府慎重研究决定，黄埔军校的两个教导团和第二期学生编成的学生总队约三千人组成黄埔校军，随右路许崇智率领的粤军行动。并决定周恩来以黄埔军校政治部主任身份参加东征，主要负责军队的政治宣传工作。
接受命令后，周恩来匆匆赶回中共广东区委，召集有关人员研究下一步工作。考虑到周恩来即将奔赴东征前线，大家同意他改任广东区委常委兼军事部部长（军委书记），由陈延年接替他做广东区委委员长。
周恩来出发前，指示铁甲车队的政治教官曹汝谦、三排排长高超率为东征部队做必要的准备。曹、高接受任务后，立即率第三排乘铁甲车队活动于被陈炯明占领的广州至石龙间的铁路线上，进行巡逻、侦察及修补铁路和发动群众的工作，掩护东征部队集中。
周恩来还对政治部的工作作出重新安排，使政治工作适应军队战事的需要。
在周恩来主持下，政治部详细制定了军队的严明纪律，要求校军官兵一律颈系红巾，身着军服。政治部还规定：军队在东征途中不蛮横无理，强拉夫役；付价购物不用军用票。就如《爱民歌》中所唱的：
扎营不要懒，
莫走人家取门板，
莫拆民房搬砖石，
莫踏禾苗坏田产，
莫打民间鸭和鸡。
政治部还发布了《敬告士兵同志》，其中写道：“我们做军人的，吃的饭，穿的衣，都不是我们自己做来的，都是人民给我们的，我们这次出发的时候，就应该千万爱护人民！不可扰乱人民！如果我们扰乱人民，人民也就用我们打倒陈炯明的手段，同样来打倒我们了。”为使宣传工作走在前面，周恩来从第二期学生中挑选出能讲广州话、客家话、潮州话的二十多人组成了武装宣传队。指示他们每到一地，张贴标语、散发传单，向人群讲演东征的意义。
1月31日，东征部队举行了隆重的誓师大会，会场里群情激昂。周恩来英气勃勃，大步跨上讲台，向全校师生做政治动员。他的语气更坚定、果敢、自信。他要求全体官兵们时刻牢记自己是革命军，是为推翻帝国主义列强和军阀的压迫，解除人民痛苦而作战的。
2月3日，身着粗灰布翻领军装、头戴大盖帽的周恩来看上去格外精神。他和校长蒋介石、苏联军事顾问加仑同乘福安兵舰出发了。年轻的周恩来对未来充满了信心。
校军指挥部的第一站是东莞县。
部队到达之前，由于当地的人民不了解这支队伍与其他旧军队有什么区别，所以一见到军队进城就纷纷逃散，临街的店铺也早早上了门板，街上一片冷清。
看到这种情况，周恩来阻止了要去砸门板的小士兵，立刻派出宣传队沿街散发孙中山的照片和一些宣传东征的材料。
一位经历过辛亥革命的老大娘，从门缝中看到孙中山的照片，顿时泪流满面。她哗地拉开门闩，冲到街上喊道：“乡亲们，有救了，孙大总统回来了。”随着这声喊叫，店门纷纷打开，人们拥到街上。
这时，闻讯赶来的东莞县商会分会的特派员赶到校军指挥部，邀请蒋介石、周恩来等到商会去，在他们通过的街道两旁，立刻燃放起鞭炮。
当晚，东莞县国民党特别党部召集市民举行联欢会，到会的群众有一千多人。在一片欢声笑语中，周恩来同东莞市民约法三章：一，县长由人民公选；二，为我军做宣传解释三，实行民治，各界均组织坚固之团体。
根据东莞县的经验，周恩来决定，以后每到一个地方，政治部先派宣传队向民众宣传革命军东征的意义和目的。
这个决定十分重要。以后，部队每到一地，人民都自愿走出家门，帮助运输，做向导报告敌情。作战时，当地群众高举红旗，吹海螺助威，还鸣枪作战，极大地鼓舞了士气，动摇了敌人的军心。政治工作初见成效。
进入东江地区的第一个重镇是淡水。东征右路军在这里同陈炯明部打了第一仗，这是有决定意义的一仗。为打好这一仗，周恩来和指挥部的官兵们进行了周密的筹划。
2月11日，蒋介石、周恩来、加仑在平湖路军司令部商讨军务，粤军第二师参谋长叶剑英向他们报告了攻取淡水城的计划。13日，东征右路军向淡水城发起进攻。
陈炯明派了一个旅凭借坚固城墙和工事死守于此。黄埔校军初上战场，缺乏经验，敌人的子弹迎面射来，心中不免紧张。但是，他们的斗志却特别旺盛。特别是共产党员在这次攻坚战中发挥了重要作用。当年参加淡水之战的李奇中后来回忆：“忽听得冲锋号紧吹紧催，我们共产党员组成的敢死队员们立刻奋勇当先，冒着枪林弹雨一口气冲到城墙脚下。”
由于周恩来率政治部成员始终坚持在战斗第一线，士兵们受到极大的鼓舞，对最终夺取淡水城起了关键性的作用。15 日，东征军队占领淡水，为第一次东征的胜利奠定了基础。
2月27日，东征部队继续东进攻克海丰。
周恩来见到了正在这里工作的彭湃。两位战友的双手紧紧地握在一起。
周恩来立即恢复了被解散两年多的海丰农会，领导重建了海丰共青团的组织。周恩来亲自出席了团的第一次会议。他推荐早期参加农民运动的彭元岳为团组织的书记；推荐彭湃的堂哥彭汉垣为海丰县县长。
周恩来还同彭湃一起研究了组建海丰中共党组织、今后的工作方针，以及恢复农会和创办海丰农民运动讲习所等问题。不久，彭湃等在海丰县成立了中共海陆丰特别支部。
淡水战役后，陈炯明收拾残部，继续与东征军队较量。
3月13日，陈炯明主力林虎部万余人同黄埔校军教导第一团千余人在棉湖交战。这一仗由于敌众我寡，打得很苦，东征部队死伤惨重。周恩来和苏联顾问立即赶到阵地鼓舞官兵坚守阵地。
战斗期间，传来孙中山逝世的消息。周恩来十分悲痛。他借此机会号召黄埔官兵们拿出勇气来，一定要为完成孙中山统一广东的遗愿而战斗。
下午，教导第一团在教导第二团和粤军第七旅支援下，击退林虎部。经过又一次反复林虎部败逃兴宁。东征军队乘胜追击，18日攻取五华，20日攻克兴宁。林虎部溃逃江西。至此，第一次东征胜利结束。
然而，取得胜利的东征军队尚未在东江站稳脚跟，从广州却传来了令人震惊的消息。
由于帝国主义的收买和支持，对东征一直取观望态度的左路滇军总司令杨希闵、中路桂军总司令刘震寰利用东征军主力远在东江地区的机会，勾结北洋军阀段祺瑞、云南军阀唐继尧、广东军阀陈炯明，在广州密谋发动武装叛乱，妄图推翻广东革命政府。
留守广州的廖仲恺焦急万分。他立即下令东征军主力火速从前线回师广州，平定杨、刘叛乱。
5 月21日，周恩来接到命令后，率黄埔校军兼程回师。
6月12日，东征部队一路风尘抵达广州郊区龙眼洞，向叛军发起进攻。经过三天的殊死战斗，在铁甲车队和广东工农群众的大力协助下，迫使杨、刘两部叛军缴械，广州局势转危为安。
就在东征部队回师广州途中，5 月30日，在上海发生日本帝国主义枪杀中国工人的血腥暴行。这次事件在历史上称为“五卅惨案”。
消息传出后，激起中华民族极大的愤慨，一场大规模的全民反帝运动席卷中国大地。为支持上海工人的反帝运动，广州群众和香港工人酝酿在广州举行声势浩大的反对帝国主义的示威大会和游行。满身硝烟的周恩来回到广州后立即投入到这场斗争。他立即同中共广东区委取得联系，和陈延年等一起研究了群众游行的具体事宜，并对各方面工作作出了周密的部署。
大游行前夕，国民党中央党部出面通知黄埔军校立即组织军人和学生参加群众游行。周恩来从已改编成党军第一旅的黄埔军校教导一、二两个团中抽调了两个营的士兵，从学校中抽调出一个营的学生军组成了黄埔军校的游行队伍。他亲自率部参加。这件事后来被蒋介石知道，他对此非常不满意。
6月23日，上午八时，身着戎装的周恩来率黄埔军校的队伍聚集到东校场开大会。会后，游行队伍以工、农、商、学、兵的次序出发，军队走在全队之后，表示了军人是和平示威民众的坚强后盾。
游行队伍三人一排，周恩来和黄埔军校的官兵们手里举着“打倒帝国主义！”“为死难同胞报仇！”的小旗，高呼着口号向前行进。这支整齐、雄壮的队伍有力地鼓舞了走在前面的群众。
游行队伍经过沙面租界对河的沙基时，驻在沙面的英军突然用步枪向手无寸铁、毫无防备的游行群众射击，接着用机枪扫射。停泊在白鹅潭上的外国军舰也开始炮击。在外国侵略者的炮火面前，示威群众纷纷倒在血泊中。走在周恩来两侧的两个人都不幸中弹身亡。烈士的鲜血溅了周恩来一身，染红了大地。
黄埔军校的士兵和学生，一面以道边石栏为依托进行还击，掩护群众撤退，一面监视对岸的情况。
由于“事起仓猝，路狭人稠”，无法躲避，当场死亡五十多人，受伤的一百多人。仅黄埔军校的学生和士兵死难的就有二十三人，受伤的五十多人。
这就是历史上著名的“沙基惨案”。
廖仲恺的夫人何香凝闻讯赶到出事地点。她看见死伤狼藉的场面，抚面大哭起来。
这时，周恩来的眼泪已被雨水冲洗净了，民族仇恨深深地埋藏在他心中。敌人的疯狂屠杀、爱国同胞的鲜血，使他对帝国主义的认识更加深刻，思想更加成熟起来。
“沙基惨案”发生的第二天，黄埔军校全体官兵通电全国军人：“我军界同胞，非以保国卫民为己任吗？现在国危矣！民族将亡矣！我军界同胞卫国保民之时机至矣！望我全国军人同胞，即时兴起，与日英法美葡各帝国主义者决一死战，以尽我军人之天职。”
不甘心失败的陈炯明在东征军队回师广州后，迅即纠集旧部重新卷土东江，侵入潮汕平原。
对陈炯明的挑衅，廖仲恺怒不可遏。广东革命政府决定第二次东征，讨伐陈炯明，彻底消灭陈炯明。
这时，党军奉命编为国民革命军第一军。国民政府军事委员会任命周恩来为国民革命军第一军政治部主任，授少将军衔。这是中国军队设立政治部的开始。对周恩来富于创造性的工作，毛泽东后来给予很高的评价。他说：“那时，军队有一种新气象，官兵之间和军民之间大体上是团结的，奋勇向前的革命精神充满了军队。那时军队设立了党代表和政治部这种制度是中国历史上没有的，靠了这种制度使军队一新其面目。”
不久，国民党中央委员会又任命周恩来为国民革命军第一军第一师党代表。在第一军三个师的党代表中，两人是共产党员，九个团的党代表中，七人是共产党员。
为适应战争的需要，第二次东征前夕，周恩来又被任命为东征军总政治部总主任，全权负责前方政治工作。
周恩来开始了战前的紧张准备。他结合第一次东征的经验，从军队中抽调了几十名共产党员到总政治部工作，领导总政治部组织一百六十多人的政治宣传队，开展军内及对敌军和民众的宣传工作。他还亲自指导了制定战时政治宣传大纲，提出肃清东江残敌，统一广东，打倒陈炯明，拯救东江人民，废除苛捐杂税，不拉夫，不筹饷，恢复农民协会，组织农民自卫军等口号。
10月1日，东征军第一军第一师召开了第二次东征誓师大会。6日，周恩来结束了在黄埔军校的工作，毅然踏上第二次东征的征途。
由于第一次东征中革命军给东江人民留下了深刻、美好的印象，因此，第二次东征进展顺利。在广大人民群众的积极支持下，部队很快抵达陈炯明的前哨阵地——惠州。
惠州，位于广州东南三百里，地处东江水陆交通枢纽。它是一座具有一千三百多年历史的古城，有“南中国第一天险”之称。在民谣中这样写道：“铁链锁孤洲，飞鹅水上游，任君天下乱 ，此地独无忧。”这正是这座天险之城的形象写照。
多年来，陈炯明就是凭借这难得的地理条件与广东革命政府抗衡。这次守城的是第六军军长杨坤如，守城部队大约有四千人。
10月11日，蒋介石和周恩来进抵惠州城郊，总指挥部就设在城南的飞鹅岭上。
他们详细地考察了地形条件，果然名不虚传。惠州城仅北门外百十米宽的陆地可以通行，这是唯一的攻城之路。讨论时，蒋介石提出：“第二次东征一开始就损失过大，太不合算，不如放弃进攻惠州，改道前进。”蒋介石的参谋长胡谦也在一旁说：“历史上从来没有以卵击石的。”周恩来不同意这种悲观意见。他说：“我们要坚定攻打惠州的决心，胜利了会对战争全局产生重要影响。”
接着，周恩来随苏联顾问来到前沿阵地，他提出自己设想的攻城方案。周恩来说：“瓮中捉鳖，鳖会咬手。在瓮的三面打击，留一面让鳖爬出来，捉鳖较为容易。”其意是说，我军只从三面围城，让出一条路，给敌人逃跑，这样，有利于破城和歼敌。
指挥部采纳了周恩来提出的这个方案。
下午二时，总攻开始。根据指挥部的命令，部队炮兵分布在惠州城外高坡上，掩护北面步兵爬城。由于城墙难爬，几次都失败了，牺牲惨重。在斗争的关键时刻，周恩来密令第三师第七团党代表蒋先云组织以共产党员和共青团员为骨干的敢死队强行登城。经过三十多个小时激战，东征军于14日攻克惠州，开辟了第二次东征前进的道路。
令周恩来悲痛的是，这次战役牺牲了二百三十八人。
15 日凌晨，周恩来和东征军各部指挥员进入惠州城。东征军在惠州第一公园隆重举行了追悼阵亡将士的大会，到会者八百多人。会场布置得十分庄严肃穆，会场中间安放了惠州阵亡将士灵位，上方悬挂着“阵亡将士精神不死”的横幅，还有“一鼓攻克天险惠城取义成仁，长留浩气；余事为后死者本责，鞠躬尽瘁，共建殊勋”等挽联。
周恩来出席了追悼大会，他满怀悲痛地宣读了祭文。周恩来说：“我们回想八个月的事，只有达到孙总理遗志的千百分之一。孙总理之志愿，第一统一广东，第二统一中国，第三打倒帝国主义。我们现在可以说刚起首，才达到总理遗志的一点，我们要想现在有第一军的力量，已有这样的成绩，假如能够把各军都化成和第一军一样，那么统一广东就在目前了。进一步就可统一中国。我们不是三师军队就够的，要把全中国的军队都要化为革命军。所以在今天追悼会里，大家要决定志向为孙总理信徒，努力奋斗，为把其他军队化为三民主义而奋斗。”
当天晚上，周恩来及苏联顾问等在惠州督办署举行军事会议，决定东征军继续东进，追歼残敌。
10月17日，周恩来和第一师师长何应钦率部从惠州出发，20日到达赤石。陈炯明军洪兆麟部二千余名在海丰东都岭、宋公岭一带布防。周恩来同何应钦制定了进攻计划。22日，周恩来同何应钦指挥第一师攻占海丰，次日占领公平。随即，东征军同林虎、洪兆麟等部万余人决战于华阳、河婆一带，在河婆击败洪部，在安流双头横流渡附近歼灭林虎部主力部队。
11月4日，何应钦率第一军两个师向潮州进发，周恩来率政治部进入汕头。东征军总指挥部乘胜追击，在福建永定全歼逃敌刘志陆部。第二次东征至此胜利结束。接着，在李济深指挥下，南征军于12月下旬肃清雷州半岛之敌，第二年收复海南岛，全歼邓本殷部。
统一广东的战争胜利结束。