购买
下载掌阅APP,畅读海量书库
立即打开
畅读海量书库
扫码下载掌阅APP

第二节
药用植物组织与组织培养

组织是由许多来源相同、形态结构相似、机能相同、又彼此密切结合、相互联系的细胞所组成的细胞群。维管植物种子萌发后,具有分生能力的细胞经过不断的分裂增加了细胞的数量,这些细胞再经过分化形成了不同的组织。单细胞的低等植物无组织形成,在这一个细胞内可行使多种不同的生理机能,其他较复杂的低等植物也无典型的组织分化,如高等的藻类植物虽然外部形态较为复杂,但是藻体内的细胞形态分化不明显;高等真菌类植物主要由菌丝组成;苔藓类植物虽然属于高等植物,开始有了类似茎、叶的形成,但是组织分化程度很低。植物进化程度越高,其组织分化越明显,分工越细致,形态结构变化越明显。蕨类植物和种子植物的根、茎、叶及种子植物的花、果实和种子等器官都是由不同组织构成,每种组织有其独立性,同时各组织之间又相互协同,共同完成器官的生理功能。

根据组织功能和形态结构特征,通常将植物组织分为以下几类:第一,分生组织:根据位置分为顶端分生组织、侧生分生组织、居间分生组织;根据来源分为原分生组织、初生分生组织、次生分生组织。第二,薄壁组织:基本薄壁组织、同化薄壁组织、吸收薄壁组织、通气薄壁组织等。第三,保护组织:表皮、周皮。第四,机械组织:厚角组织、厚壁组织。第五,输导组织:木质部(导管与管胞),韧皮部(筛管、伴胞与筛胞)。第六,分泌组织:外部分泌组织(腺毛、蜜腺);内部分泌组织(分泌细胞、分泌腔、分泌道和乳汁管)。

不同种植物同一组织常具有不同的结构特征,是中药材鉴定常用而又可靠的方法,特别是药材性状鉴定较为困难品种,或某些中成药及粉末状药材,显微鉴定是经常利用的有效方法。例如直立百部,蔓生百部,对叶百部,这三种药材外部形态相似,但内部组织却因构造不同而易于区别。

此外值得注意的是种内形态特征的差异,在同一种植物内,因为生长期不同,生态环境不同,都会对植物组织形态产生影响,这也是生物多样性在种内的一个表现。

一、药用植物组织

(一)分生组织

在种子胚根、胚芽的顶端,以及生长中的植物体根尖、茎尖等,都有一些能不断进行分生活动的细胞团,这些细胞连续或周期性的分裂,使细胞数量不断增加,再经过细胞分化,形成各种不同的成熟细胞和组织。这些存在于植物体不同生长部位,并能保持细胞分裂机能不断产生新细胞的细胞群,称为分生组织。

分生组织的细胞体积小,排列紧密,没有细胞间隙,细胞壁薄,不具纹孔,细胞核大质浓,无液泡和质体分化,但含线粒体、高尔基体、核蛋白体等细胞器。分生组织细胞代谢功能旺盛,不断进行分裂,分生出的细胞一部分保持连续分生能力,另一部分细胞将陆续分化成为具有一定形态特征和一定生理功能的细胞,形成各种成熟组织,这些组织一般不再分化,生理功能、形态特征不再改变,所以也称为永久组织。

1.根据分生组织性质,来源分类

(1)原分生组织 是由种子的胚活动后保留下来的,位于根、茎最先端。这些细胞为胚性细胞,没有任何分化,可长期保持分裂能力,特别是在生长季节,分裂能力更加旺盛。

(2)初生分生组织 是由原分生组织细胞分裂出来的细胞组成,位于原分生组织之后,这些细胞一方面仍保持分裂能力,同时细胞已经开始较浅的分化。如茎的初生分生组织已可看到分化为三种不同的分生组织,既原表皮层、基本分生组织和原形成层。在这三种初生分生组织的基础上,再进一步分生、分化形成其他各种组织。

(3)次生分生组织 是由已经分化成熟的薄壁组织经过生理上和结构上的变化,重新恢复分生机能而形成的分生组织。如裸子植物和双子叶植物一些种类的表皮可以形成木栓形成层;皮层、髓射线、中柱鞘等可以形成维管形成层、木栓形成层等,这些分生组织一般成环状排列,与器官的轴向平行。次生分生组织分生的结果使根和茎这两个轴状器官不断加粗生长形成了次生构造,即次生保护组织和次生维管组织。

2.据分生组织在植物体内所处的位置不同分类

(1)顶端分生组织 是位于两个轴状器官根、茎最顶端的分生组织。这部分细胞能较长期的保持旺盛的分生能力,细胞不断分裂、分化,使根、茎不断沿着轴向生长,使植物体不断长高,根不断增长。

(2)侧生分生组织 主要存在于裸子植物和双子叶植物的根和茎内,包括形成层和木栓形成层,它们分布在植物体内部成环状排列并与轴向平行。这些分生组织沿着切向进行分生,使轴状器官的半径不断加大,结果是根和茎不断进行加粗生长。

(3)居间分生组织 是从顶端分生组织细胞保留下来的或是由已经分化的薄壁组织重新恢复分生能力而形成的分生组织,位于茎、叶、子房柄、花柄等成熟组织之间,居间分生组织只能保持一定时间的分裂与生长,以后将转变为成熟组织。

禾本科植物茎的节间基部常见这种分生组织,如薏苡、玉米、小麦的拔节、抽穗就是居间分生组织细胞旺盛的分裂和迅速分化生长的结果。葱、韭菜、蒜、鸢尾、松等叶的基部以及蒲公英、车前的总花柄顶端也存在居间分生组织。韭菜、葱、蒜等叶子上部被割掉后,还可以长出新的叶片来,就是居间分生组织活动的结果。花生果实生长在地下是一个特殊的例子,子房内的胚珠受精后,子房柄的居间分生组织分生活动使子房柄伸长,将子房推入土中发育成熟。

综上所述,通常认为顶端分生组织,就其发生来说,属于原分生组织,但原分生组织和初生分生组织之间无明显分界,所以顶端分生组织也包括初生分生组织。侧生分生组织则相当于次生分生组织;居间分生组织则相当于初生分生组织。

(二)薄壁组织

薄壁组织也称为基本组织,是植物体分布最广、占有体积最大、最基本并最重要的部分。薄壁组织贯通在植物体或器官内以不同方式形成一个连续的组织,如根、茎中的皮层和髓部,叶片的叶肉组织以及花的各部分,果实的果肉,种子的胚乳等,主要由不同类型的薄壁组织构成。薄壁组织广泛存在植物体的各部分,也是植物体内最基本的组成,植物体的机械组织,输导组织、分泌组织等都分布于薄壁组织中,并依靠薄壁组织将各部分组织有机地结合起来,使其形成一个整体。

薄壁组织在植物体内担负着同化、储藏、吸收、通气、营养等功能。大多数薄壁组织细胞较大,均为生活细胞,排列疏松,形状有球形、椭圆形、圆柱形、长方形、多面体等。细胞壁通常较薄,主要是由纤维素和果胶质构成,纹孔是单纹孔,液泡较大,根据不同功能细胞含有不同种的原生质体。

薄壁组织细胞分化程度较浅,具潜在的分生能力,在一定条件下,可转变为分生组织或进一步分化成为其他组织,如纤维、石细胞、分泌细胞等。薄壁组织对创伤恢复,不定根和不定芽的产生,嫁接的成活以及组织离体培养等具有实际意义。离体的薄壁组织,甚至单个薄壁细胞,在一定培养条件下,都可能发育成为新的个体植株。

薄壁组织的可缩性很强,生态环境对薄壁组织的形态特征、薄壁组织的多少都有着很大的影响,在干旱条件下和在潮湿环境下同种植物薄壁组织的表现就有很大的差别。在不同生长时期薄壁组织的特征也是明显不同的,这些都是在生药鉴定中容易忽视的问题,应引起注意。

根据细胞结构和生理功能不同,薄壁组织通常分为以下几类:

1.基本薄壁组织

基本薄壁组织为植物体内最基本的组织,广泛存在于植物体内各处。细胞形状多样,有球形、不规则形、圆柱形、多面体形等,有时也随着其他相邻细胞形状而变化,如薄壁细胞等。薄壁组织细胞质较稀薄,液泡较大,细胞排列疏松。如在薄壁组织分布较广的根、茎皮层和髓部。基本薄壁组织主要起填充和联系其他组织作用,在一定的条件下可以转化为次生分生组织,在旱生条件下薄壁组织细胞通常较小,所占比例也较少,在水分充足的条件下细胞较大并排列也较为疏松。

2.同化薄壁组织

同化薄壁组织是存在于植物体表面的绿色薄壁组织,细胞主要特征是含有叶绿体,能进行光合作用。植物体的叶片、草本植物茎以及一些木本植物幼嫩的枝条、花的萼片、绿色果实等器官表面易受光照的部分。这些细胞的形态随着分布位置和功能而变化,如叶肉组织中的栅栏组织细胞为柱形,海绵组织细胞为不规则形,皮层外层同化组织细胞多为排列整齐规则的扁平细胞等。

3.贮藏薄壁组织

同化组织光合作用产物除了一部分供给植物体本身生命活动所需外,还有一些将以不断积累的方式贮存于某些薄壁组织中,这种聚积营养物质的薄壁组织称为贮藏薄壁组织。贮藏薄壁组织多存在于植物的根、根状茎、果实和种子中。贮存的营养物质主要是淀粉、蛋白质、脂肪和糖类等,而且在同一细胞中可以贮存两种或两种以上的物质,如花生种子的子叶细胞中同时贮存有蛋白质、脂肪和淀粉,蓖麻种子的胚乳中贮存有大量的蛋白质和脂肪油,而马铃薯块茎中薄壁组织则贮存大量的淀粉粒。

在多数情况下,贮藏的物质可以溶解在细胞液中,也可呈固体状态或液体状分散存在于细胞质中。还有一类贮藏物质不贮存在于细胞腔内,而是沉积在细胞壁内,如柿子、椰枣、天门冬属等植物种子的胚乳细胞壁上贮存的半纤维素。

某些肉质植物如仙人掌茎,芦荟、龙舌兰以及景天等植物的叶片中常有大的薄壁细胞,这类细胞的细胞壁薄,液泡大,含有大量水分,又称为贮水薄壁组织。

4.吸收薄壁组织

吸收薄壁组织主要位于根尖端的根毛区,这区域的部分表皮细胞外切向壁向外形成细长的突起,称为根毛。吸收薄壁组织的主要生理功能是从周边环境吸收水分和营养物质,根毛数量的增加的结果是增加了与土壤相接触的面积,同时增加了植物根的吸收面积。根毛的数量和根毛的长短和周边环境的水分多少有着直接的关系,水分丰富根毛则少而短。

5.通气薄壁组织

水生植物和沼泽植物体内,薄壁组织中具有相当发达的细胞间隙,这些细胞间隙在发育过程中逐渐互相连接,形成管道或气腔,是水生植物气体交换的通道,利于呼吸时气体流通,这是植物体长期在水生环境下生存而形成的适应特征。这种构造对植物也有着漂浮作用,以便于水生植物漂浮在水面,有效的利用和进行光合作用,如菱和莲的根状茎等。

(三)保护组织

植物各个器官的表面,都由一层或数层排列紧密整齐的细胞构成,保护着植物的内部组织,控制植物体内外气体交换和水分过分蒸腾,病虫侵害以及外界机械损伤等,这种组织就是保护组织。根据来源和结构不同,保护组织又可分为初生保护组织——表皮,次生保护组织——周皮。

1.表皮

表皮是由初生分生组织的表皮原分化而来的,通常仅由一层生活细胞构成,少数植物原表皮层细胞可与表面平行分裂,产生2~3层细胞形成复表皮,如夹竹桃和印度橡胶树叶等。

由于表皮细胞的保护功能,细胞形状常为扁平的方形、长方形、多角形、不规则等,很多种细胞的边缘呈波状、波齿状等多种变化,但是细胞排列紧密,无胞间隙;细胞内有细胞核,大型液泡及少量细胞质,其细胞质紧贴细胞壁,一般不含叶绿体,细胞呈无色透明状等是表皮细胞的统一特征。表皮细胞常有白色体和有色体,也可贮有淀粉粒、晶体、单宁、花青素等。表皮细胞的细胞壁一般是厚薄不一,外壁较厚,内壁最薄,侧壁也较薄。表皮细胞的外壁还常有不同类型的特殊结构和附属物。表皮细胞的细胞壁常角质化,并在表皮细胞的外切向壁表面形成一层明显的角质层。有的植物蜡质渗入到角质层里面或分泌到角质层之外,形成蜡被,保护植物体内的水分过分散失,如甘蔗和蓖麻茎,樟树叶、葡萄、冬瓜的果实,乌桕的种子等都具有明显的白粉状蜡被。还有的植物表皮细胞壁矿质化,如木贼和禾本科植物的硅质化细胞壁等,可使器官表面粗糙、坚实。

表皮除典型的表皮细胞外,另有不同类型的特化细胞,如表皮上分布的气孔器,是由保卫细胞、副卫细胞构成,以及不同类型的毛茸等。这些角质层、蜡被、气孔器、各式毛茸等常又被称为表皮的附属结构,表皮的各式附属结构的变化非常大,主要是因为生态环境引起,同种植物在不同环境下生长,其各种附属结构表现差别很大,如白头翁、火绒草主要是生长在旱生环境,其表面具有很多毛茸,当将其移植在水分充足的环境,其表皮毛将大量减少。

(1)气孔器 植物体的叶片和幼嫩的茎枝上,表面不是全部被表皮细胞所覆盖的,表皮层还留有许多孔隙用来进行气体交换的通道,双子叶植物的孔隙是被两个半月形的保卫细胞包围,两个保卫细胞凹入的一面是相对的,中间的孔隙即为气孔,气孔连同周围的两个保卫细胞合称为气孔器,通常将气孔与气孔器做同一名词使用。气孔除具有控制气体交换作用外,对调节水分蒸散作用也至关重要。

保卫细胞是气孔周围的两个细胞,通常比周围的表皮细胞小,含有丰富的叶绿体和明显的细胞核,是生活细胞。保卫细胞在形态上与表皮细胞不同,表面观为肾形,因生理功能的原因细胞壁的增厚情况特殊,保卫细胞和表皮细胞相邻的细胞壁较薄,而内凹处与气孔相接触的细胞壁较厚,当保卫细胞充水膨胀时,向表皮细胞一方被弯曲成弓形,将气孔器分离部分的细胞壁拉开,使中间气孔张开,便于气体交换及水分的蒸腾和散失。当保卫细胞失水时,膨压降低,保卫细胞向回收缩,气孔缩小以至闭合,阻止气体交换及水分散失。

气孔的张开和关闭都受着外界环境条件如温度、湿度、光照和CO 2 浓度等多种因素的影响。

气孔的数量和大小常随器官的不同和所处的环境条件不同而异,如叶片的气孔较多,茎上的气孔较少,而根上几乎没有。即使在同一种植物的不同叶上,同一叶片的不同部位都可能有所不同。在叶片上气孔可发生在叶的两面,也可能发生在一面。气孔在表皮上的位置可处在不同的水平面上,可与表皮细胞同在一平面上,有的又可凹入或凸出叶表面。

与保卫细胞相接触的周围还有一个或多个与表皮细胞形状不同或相同的细胞,叫副卫细胞,根据植物种类,副卫细胞按一定顺序排列。组成气孔器的保卫细胞和副卫细胞的排列关系,称为气孔轴式或气孔类型。

双子叶植物的常见气孔轴式有:平轴式(平列式)气孔器周围通常有两个副卫细胞,其长轴与保卫细胞和气孔的长轴平行。如茜草叶、番泻叶、常山叶、菜豆叶、花生叶等。直轴式(横列式)气孔器周围通常有两个副卫细胞,其长轴与保卫细胞和气孔的长轴垂直。常见于石竹科、爵床科(如穿心莲叶)和唇形科(如薄荷、紫苏)等植物的叶。不等式(不等细胞型)气孔器周围的副卫细胞为3~4个,但大小不等,其中一个明显小些。常见于十字花科(如菘蓝叶)、茄科的烟草属和茄属等植物的叶。不定式(无规则型)气孔器周围的副卫细胞数目不定,其大小基本相同,形状与其他表皮细胞基本相似。如艾叶、桑叶、枇杷叶、洋地黄叶等。环式(辐射型)气孔器周围的副卫细胞数目不定,其形状比其他表皮细胞狭窄,围绕气孔器排列成环状。如茶叶、桉叶等。

各种植物具有不同类型的气孔轴式,而在同一植物的同一器官上也常有两种或两种以上类型,根据气孔轴式的不同类型、分布情况等,可以作为药材鉴定的依据。

单子叶植物气孔的类型也很多,禾本科植物的气孔器有两个狭长的保卫细胞,膨大时两端成为小球形,好像并排的一对哑铃,中间窄的部分细胞壁特别厚,两端球形部分的细胞壁比较薄,当保卫细胞充水时,两端膨胀为球形,气孔开启;当水分减少时,保卫细胞萎缩,气孔关闭或变小。在保卫细胞的两边还有两个平行排列,略呈三角形的副卫细胞,对气孔的开启有辅助作用,如淡竹叶等。

裸子植物的气孔一般都凹入叶表面很深的位置,好像悬挂在副卫细胞之下。裸子植物气孔的类型较多,对裸子植物气孔类型的分类,需要考虑副卫细胞的排列关系与来源。

(2)毛茸 是植物体表面最重要、并为普遍存在的附属结构,毛茸具有保护、减少水分过分蒸发、分泌物质等作用。根据毛茸的形态结构和功能常可分为两种类型。

腺毛:是能分泌挥发油、树脂、黏液等物质的毛茸,为多细胞构成,由腺头和腺柄两部分组成。腺头由一个或几个分泌细胞组成的圆球状体,具分泌作用。腺柄也有单细胞和多细胞之分,如薄荷、车前、莨菪、洋地黄、曼陀罗等叶上的腺毛。另外,在薄荷等唇形科植物叶片上,还有一种无柄或短柄的腺毛,其头部常由8个或6~7个细胞组成,略呈扁球形,排列在同一平面上,表面观呈放射状,称为腺鳞。还有一些较为特殊类型的腺毛,如广藿香茎、叶和绵马贯众叶柄及根状茎中的薄壁组织内部的细胞间隙中有腺毛存在,称为间隙腺毛。还有食虫植物的腺毛能分泌多糖类物质以吸引昆虫,同时还可分泌特殊的消化液,能将捕捉到的昆虫分解消化等。

非腺毛:由单细胞或多细胞构成,无头、柄之分,末端通常尖狭,不能分泌物质,单纯起保护作用。根据组成非腺毛的细胞数目、形状以及分枝状况不同而有多种类型,种类虽然很多,但常以物体形状命名。常见的有:线状毛:毛茸呈线状,由单细胞形成的,如忍冬和番泻叶的毛茸;也有多细胞组成单列的,如洋地黄叶上的毛茸;还有由多细胞组成多列的,如旋覆花的毛茸;还有的毛茸表面可见到角质螺纹,如金银花。还有的壁上有疣状突起,如白花曼陀罗。棘毛:细胞壁一般厚而坚硬,细胞内有结晶体沉积。如大麻叶的棘毛,其基部有钟乳体沉积。分枝毛:毛茸呈分枝状。如毛蕊花、裸花紫珠叶上具有的毛。丁字毛:毛茸呈丁字形。如艾叶和除虫菊叶的毛。星状毛:毛茸呈放射状,具分枝。如芙蓉和蜀葵叶、石韦叶和密蒙花的毛茸。鳞毛:毛茸的突出部分呈叠落的鳞片状。如胡颓子叶的毛。

各种不同形态的毛茸是作为中药材鉴定的重要依据,但在同一种药用植物甚至同一器官上也常存在不同形态的毛茸。例如在薄荷叶上既有非腺毛,又有不同形状的腺毛和腺鳞。毛茸的存在,加强了植物表面的保护作用,密被的毛茸可不同程度的阻碍阳光的直射,降低温度和气体流通速度,减少水气的蒸发,许多干旱地区植物的表皮常密被不同类型的毛茸。

此外,毛茸还有保护植物免受动物啃食和帮助种子撒播的作用。

另外,有的植物花瓣表皮细胞向外突出如乳头状,称为乳头状细胞或乳头状突起。乳头状细胞可以认为是表皮细胞和毛茸之间的中间形式。

毛茸最主要的生理功能是保护作用,毛茸的多少除了个体本身的遗传因素外,也受环境因素的影响,最直接的环境因子是光照和水分,同种植物在光强水少的环境下往往毛茸较多,在光弱水多的环境下则相反。

2.周皮

周皮是植物的次生保护组织,大多数草本植物终生只有初生保护组织——表皮,木本植物的根和茎的表皮仅存在其幼年时很短时期,当次生生长开始,由于根和茎进行加粗生长,初生保护组织表皮层被破坏,次生保护组织周皮形成,代替表皮行使保护作用。周皮是由木栓层、木栓形成层、栓内层三种不同组织构成的复合组织。

次生保护组织周皮是由木栓形成层分生分化形成的,发生于裸子植物和被子植物双子叶植物根和茎的次生生长。在根中,木栓形成层通常是由中柱鞘细胞转化形成,而在茎中则多由皮层或韧皮部薄壁组织转化形成,也可由表皮细胞发育而来。木栓形成层细胞活动时,向外切向分裂,产生的细胞逐渐分化成木栓层细胞,随着植物的生长,木栓层细胞层数不断增加,通常木栓细胞呈扁平状,细胞内原生质体解体,为死亡细胞,排列紧密整齐,无细胞间隙,细胞壁栓质化,常较厚,栓质化细胞壁不易透水、透气,是很好的保护组织。木栓形成层向内分生的细胞经过分化将形成栓内层,栓内层细胞是生活的薄壁细胞,通常排列疏松,茎中栓内层细胞常含叶绿体,所以又称绿皮层。除了根和茎有木栓层存在外,还有一些植物的块根、块茎的表面也可存在木栓层。

皮孔,在周皮形成过程中,位于表皮气孔下面的木栓形成层向外分生更多的薄壁细胞,这些细胞呈椭圆形、圆形等,排列疏松,有比较发达的细胞间隙,不栓质化,称为填充细胞,由于填充细胞数量不断增多,结果将表皮突破,形成圆形或椭圆形的裂口,称为皮孔。皮孔是次生保护组织气体交换的通道,皮孔的形成使植物体内部的生活细胞仍然可获得氧气。在木本植物的茎、枝上常可见到直的、横的或点状开裂的突起就是皮孔,其大小、形态、分布可随不同种而有变化。

(四)机械组织

机械组织(mechanical tissue)是具有巩固和支持植物体功能的组织,共同特点是细胞多为细长形、细胞壁全面或局部增厚。植物的幼苗及器官的幼嫩部分没有机械组织或不发达,随着植物的不断生长发育,才分化出机械组织细胞。根据细胞的形态、结构及细胞壁增厚的方式,常将机械组织分为厚角组织和厚壁组织。

1.厚角组织

厚角组织是由生活细胞构成并且是初生壁增厚的机械组织,细胞内含有原生质体,具有潜在分生能力,接近表皮的厚角组织常具有叶绿体,可进行光合作用。纵切面观察厚角组织细胞是细长形,两端可略呈平截状、斜状或尖形;横切面细胞常呈多角形,不规则形等。细胞结构特征是具有不均匀加厚的初生壁,细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质,厚角组织有一定的坚韧性、可塑性和延伸性,既可支持植物直立,也适应于植物的迅速生长。

厚角组织常存在于草本植物茎和尚未进行次生生长的木质茎中,以及叶片主脉上下两侧、叶柄、花柄的外侧部分,多直接位于表皮下面,或离开表皮只有一层或几层细胞,或成环、成束分布,如益母草、薄荷、南瓜等植物茎,芹菜叶柄的棱角处就是厚角组织集中分布的位置。根内很少形成厚角组织,但如果暴露在空气中,则常可发生。

根据厚角组织的细胞壁加厚方式的不同,常可分为三种类型:

(1)真厚角组织 又称为角隅厚角组织,是最普遍存在的一种类型,细胞壁显著加厚的部分发生在几个相邻细胞的角隅处。如薄荷属、曼陀罗属、南瓜属、桑属、酸模属和蓼属等植物。

(2)板状厚角组织 又称为片状厚角组织,细胞壁加厚的部分主要发生在切向壁,如细辛属、大黄属、地榆属、泽兰属、接骨木属等植物。

(3)腔隙厚角组织 是具有细胞间隙的厚角组织,细胞壁面对胞间隙部分加厚,如夏枯草属、锦葵属、鼠尾草属、豚草属等植物。

2.厚壁组织

厚壁组织的成熟细胞是没有原生质体的死亡细胞,细胞都具有全面增厚的次生壁,常有明显的层纹和纹孔沟,并大多为木质化的细胞壁,细胞腔较小。根据细胞的形态不同,可分为纤维和石细胞。

(1)纤维 通常为两端尖斜的长形细胞,具有明显增厚的次生壁,加厚的主要成分是木质素和纤维素,壁上有少数纹孔,细胞腔小或几乎没有。

纤维可以发生于维管组织和基本组织中。根据纤维在植物体内发生的位置,纤维通常可分为木纤维和木质部外纤维,木质部外纤维因为主要存在于韧皮部中,所以常称为韧皮纤维。

木纤维分布在被子植物的木质部中,为长轴形纺锤状细胞,长度约为1mm,细胞壁均木质化,细胞腔小或无,壁上具有不同形状的退化具缘纹孔或裂隙状单纹孔。木纤维细胞壁增厚的程度随植物种类和生长部位以及生长时期不同而异。如黄连、大戟、川乌、牛膝等一些木纤维壁较薄,而栎树、栗树的木纤维细胞壁则常强烈增厚。就生长季节来说,春季生长的木纤维细胞壁较薄,而秋季生长的木纤维细胞壁较厚。木纤维细胞壁厚而坚硬,增加了植物体的机械巩固作用,但木纤维细胞的弹性、韧性较差,脆而易断。

在某些植物的次生木质部中,还有一种为木质部中最长的细胞,壁厚并具有裂缝式的单纹孔,纹孔数目较少,这种细胞称为韧型纤维。如沉香、檀香等木质部中的纤维。

木纤维仅存在于被子植物的木质部中,在裸子植物的木质部中没有纤维,主要由管胞组成,管胞同时具有输导和机械作用,从植物演化角度表明了裸子植物组织分工不如被子植物详细,也是裸子植物原始于被子植物的特征之一。

木质部外纤维,因为这类纤维多分布在韧皮部中,也常称为韧皮纤维,实际上木质部外纤维可以广泛存在除了木质部以外的任何部位。除了韧皮部,基本组织或皮层中也常存在;一些单子叶植物特别是禾本科植物的茎中,离表皮不同距离有由基本组织发生的纤维成环状存在,在维管束周围有由原形成层形成的分化程度不同的纤维形成了维管束鞘;一些藤本双子叶植物茎的皮层中,也常有环状排列的皮层纤维和维管束周围的环管纤维等。

木质部外纤维细胞多呈更长的纺锤形,两端尖,细胞壁厚,细胞腔成缝隙状,在横切面上细胞常呈圆形、长圆形等,细胞壁常呈现出同心纹层,细胞壁增厚的成分主要是木质素和纤维素。以木质素为主要成分的木质部外纤维木质化程度较深,机械力量较强,有如木纤维,如一些禾本科植物基本组织中形成环状排列的纤维、维管束鞘等;以纤维素为主要成分的纤维更加细长,具较强的韧性,伸拉力较大,如苎麻、亚麻、桑等植物的纤维。

此外,在植物类中药材鉴定中,还可以见到以下几种特殊类型:

晶鞘纤维(晶纤维):在纤维束外围有一层或几层含有晶体的薄壁细胞,这种由纤维束和含有晶体的薄壁细胞组成的复合体称为晶鞘纤维。这些薄壁细胞中,有的含有方晶,如甘草、黄柏、葛根等;有的含有簇晶,如石竹、瞿麦等;有的含有石膏结晶,如柽柳等。

嵌晶纤维:纤维细胞次生壁外层嵌有一些细小的草酸钙方晶或砂晶,如冷饭团的根和南五味子的根皮中的纤维嵌有方晶,草麻黄茎的纤维嵌有细小的砂晶。

分枝纤维:长梭形纤维顶端具有明显的分枝,如东北铁线莲根中的纤维。

分隔纤维:是一种细胞腔中生有菲薄横隔膜的纤维,如姜、葡萄属植物的木质部和韧皮部中以及在茶藨子的木质部里均有分布。

(2)石细胞 与纤维相比石细胞是较短的厚壁细胞。石细胞是由薄壁细胞的细胞壁强烈增厚而形成,形状多样并特别硬化的厚壁细胞。石细胞的种类较多,形状不同,有椭圆形、类圆形、类方形、不规则形等近等径的石细胞,也有分枝状、星状、柱状、骨状、毛状等多种形状的石细胞。石细胞的次生壁极度增厚,均木质化,大多数细胞腔极小,细胞在发育过程中原生质体消失,成为具有坚硬细胞壁的死亡细胞。

石细胞在发育过程中细胞壁不断增厚,细胞壁上的单纹孔因此变长而形成沟状,细胞壁越厚,细胞腔就越小,细胞内壁的表面积也越小,开始形成很多的纹孔彼此汇合而形成分枝状。石细胞多见于茎、叶、果实、种子中,可单独存在也可成群分散于薄壁组织中,有时也可连续成环状分布,如肉桂的石细胞,梨的果肉中的石细胞。石细胞也常存在于某些植物的果皮和种皮中,组成坚硬的保护组织,如椰子、核桃等坚硬的内果皮及菜豆、栀子种皮的石细胞等。石细胞亦常见于茎的皮层中,如黄柏、黄藤;或存在于髓部,如三角叶黄连、白薇等;或存在于维管束中,如厚朴、杜仲、肉桂等。

不同形状的石细胞是生药鉴定的重要特征之一。药材中最常见的是不同形态近等径的石细胞,梨果肉中的近等径的圆形或类圆形石细胞,黄芩、川乌根中的长方形、类方形、多角形壁较薄的石细胞,乌梅种皮呈壳状、盔状石细胞,厚朴、黄柏中的不规则状石细胞。此外还有一些较特殊类型的石细胞。毛状石细胞,石细胞形状如同较长的非腺毛,如山桃种皮中的石细胞。长分枝状石细胞,石细胞呈分枝状,如山茶叶柄中的石细胞。分隔石细胞,石细胞腔内产生薄的横膈膜,如虎杖根及根茎中的石细胞。含晶石细胞,在细胞腔内含有不同形状的晶体,如南五味子根皮、桑寄生叶等。嵌晶石细胞,石细胞的次生壁外层嵌有非常细小的草酸钙晶体,并常稍突出于表面,如紫荆皮石细胞。

(五)输导组织

植物体内的水分、溶解在水中的无机盐类、营养物质以及光合作用形成的光合产物,都要在各器官、各组织之间、各细胞之间流通输导。低等植物的营养输送主要是通过细胞间的转输;高等植物的蕨类植物、裸子植物、被子植物在长期进化过程中,逐渐形成了完善的输导系统——维管组织。

输导组织也称维管组织,是植物体内运输水分和养料的组织。输导组织的细胞一般呈管状,上下相接,遍布于整个植物体内。根据输导组织的构造和运输物质的不同,可分为两类:一类是木质部,主要由导管或管胞组成,功能是运输水分和溶解于水中的无机盐及其他营养物质;另一类是韧皮部,主要由筛管、伴胞或筛胞组成,功能是运输溶解状态的同化产物。

1.木质部

木质部是疏导水分和溶解在水中的无机盐和其他营养物质的组织,主要由导管和管胞组成。

(1)导管 是被子植物的主要输水管状结构,在少数原始被子植物和一些寄生植物中无导管,如金粟兰科草珊瑚属植物,而少数进化的裸子植物和蕨类植物,如麻黄科植物和蕨属植物则有导管存在。导管是由一系列没有原生质体的长管状细胞组成,组成导管的细胞称为导管分子,其横壁溶解成穿孔,具有穿孔的横壁称穿孔板,彼此首尾相连,成为一个贯通的管状结构。导管的长度由数厘米至数米,由于每个导管分子横壁的溶解,输水效率较高,每个导管分子的侧壁上还存在有许多不同类型的纹孔,相邻的导管又可以靠侧壁上的纹孔运输水分。如导管分子之间的横壁溶解成一个大的穿孔称为单穿孔板,有些植物中的导管分子横壁并未完全消失,而在横壁上形成许多大小不同形状的穿孔,如椴树和一些双子叶植物的导管分子横壁上留有几条平行排列的长形穿孔,称为梯状穿孔板,麻黄属植物导管分子横壁具有很多圆形的穿孔形成了特殊的麻黄式穿孔板,而紫葳科一些植物的导管分子之间形成了网状穿孔板等。

导管在形成过程中,其木质化的次生壁并不是均匀增厚,形成了不同的纹理或纹孔。根据导管增厚所形成的纹理不同,常可分为下列几种类型:

环纹导管:在导管壁上是成一环一环规则的木质化次生壁增厚,环状的增厚之间仍为较薄的纤维素初生壁,有利于生长而伸长。环纹导管直径较小,常出现在器官的幼嫩部分,如南瓜茎、凤仙花的幼茎中,半夏的块茎中。

螺纹导管:在导管壁上有一条或数条成螺旋带状木质化增厚的次生壁。螺旋状增厚之间也是初生壁,具有较强的伸缩性,适应于伸长生长。螺纹导管直径也较小,亦多存在于植物器官的幼嫩部分,并同环纹导管一样,容易与初生壁分离,如南瓜茎、天南星块茎中常见,常见的“藕断丝连”中的丝就是螺纹导管中螺旋带状的次生壁与初生壁分离开的现象。

梯纹导管:在导管壁上增厚的并与未增厚的初生壁部分间隔成梯形。这种导管木质化的次生壁占有较大比例,分化程度较深,不易进行伸长生长。多存在于器官的成熟部分,如葡萄茎、常山根中的梯纹导管。

网纹导管:导管增厚的木质化次生壁交织成网状,网孔是未增厚的部分。网纹导管的直径较大,多存在于器官的成熟部分,如大黄、苍术根的网纹导管。

孔纹导管:导管次生壁几乎全面木质化增厚,未增厚部分为单纹孔或具缘纹孔,前者为单纹孔导管,后者为具缘纹孔导管。导管直径较大,多存在于器官的成熟部分,如甘草根、芍药根、拳参根茎的具缘纹孔导管等。

实际观察中,经常发现一些同一导管可以同时存在螺纹和环纹状增厚,螺纹和梯纹等两种以上类型的导管,如南瓜茎的纵切中常可见到典型的环纹和螺纹存在于同一导管上。另外还有一些导管呈现出中间类型,如大黄根的粉末中常可见到网纹未增厚的部分横向延长,出现了梯纹和网纹的中间类型,这种类型又往往称为梯网纹导管。

随着植物的生长,一些较早形成的导管常相继失去其功能,其相邻薄壁细胞膨胀,并通过导管壁上未增厚部分或纹孔侵入导管腔内,形成大小不同的囊状突出物,这种堵塞导管的囊状突出物就叫做侵填体。早期原生质和细胞核等可随着细胞壁的突进而流入其中,后来则由丹宁、树脂等物质填充,由于侵填体的影响,体内的水溶液运输并不是由一导管从下直接向上输导的,而是经过多条导管曲折向上输导。侵填体的产生对病菌侵害起到一定防腐作用,其中有些物质也是中药有效成分。

(2)管胞 是绝大部分裸子植物和蕨类植物的输水细胞,同时还具有支持作用。在被子植物的木质部中也可发现管胞,特别是叶柄和叶脉中,不是主要输导分子。管胞和导管分子在形态上有很大的相似性,由于其细胞壁次生加厚,并木质化,细胞内原生质体消失而成为死亡细胞,并其木质化次生壁的增厚也常形成类似导管的环纹、螺纹、梯纹、孔纹等类型。管胞与导管也有明显的差别,每个管胞是一个细胞,呈长管状,但两端尖斜不形成穿孔,相邻管胞彼此间不能靠端部连接进行输导,而是通过相邻管胞侧壁上的纹孔输导水分,所以其输导功能比导管低,为一类较原始的输导组织。导管、管胞在药材粉末鉴定中很难分辨,而细胞类型的鉴别可以采用解离的方法将细胞分开,观察单个管胞和导管分子的形态。

在松科、柏科一些植物的管胞上,可见到一种典型的具有纹孔塞的具缘纹孔。纤维管胞是管胞和纤维之间一种长梭形中间类型细胞,末端较尖,细胞壁上具双凸镜状或裂缝状开口的纹孔,厚度常介于管胞和纤维之间,如沉香、芍药、天门冬、威灵仙、紫草、升麻、钩藤等。

2.韧皮部

韧皮部是构成维管束的另一组成部分,是运输光合作用产生的有机物质如糖类和其他可溶性有机物的结构,主要由筛管、伴胞和筛胞等管状细胞组成。

(1)筛管 主要存在被子植物的韧皮部中,是由一些生活的管状细胞纵向连接而成。组成筛管的每一个管状细胞称为筛管分子,筛管细胞是生活细胞,但细胞成熟后细胞核消失,筛管细胞壁主要是由纤维素构成。

筛管中两相连的筛管分子的横壁上有许多小孔,称为筛孔,具有筛孔的横壁称为筛板;筛板两边的原生质丝,通过筛孔而彼此相连,与胞间连丝的情况相似。在秋季这些原生质丝常浓缩联合形成较粗壮的联络索。有些植物的筛孔也存在于筛管的侧壁上,通过侧壁上的筛孔,使相邻的筛管彼此相联系。在筛板上或筛管的侧壁上筛孔集中分布的区域称为筛域。在一个筛板上只有一个筛域的称为单筛板,分布数个筛域的则称为复筛板。联络索通过筛孔上下相连,彼此贯通,形成同化产物运输的通道。筛管的不同发育期形态结构都有很大的变化,早期阶段细胞中有细胞核和浓厚的细胞质,在筛管形成过程中,细胞核逐渐溶解而消失,细胞质减少,筛管形成后,筛管细胞成为无核的生活细胞。另有人研究认为筛管细胞始终有细胞核存在,并是多核的生活细胞,但是细胞核小并且分散,不易观察到。

筛管分子也有从形成到失去作用的过程。筛板形成后,在筛孔的四周围绕联络索可逐渐积累一些特殊的碳水化合物,称为胼胝质,随着筛管的不断老化,胼胝质将会不断增多,最后形成垫状物,称为胼胝体,一旦胼胝体形成,筛孔将会被堵塞而使联络索中断,筛管也将失去运输功能。多年生的单子叶植物筛管可保持长期的输导功能,甚至整个生活期。一些多年生的双子叶植物筛管在冬季来临前形成胼胝体使筛管暂时停止其输导作用,来年春季胼胝体溶解,筛管又逐渐恢复输导功能,一些较老的筛管形成胼胝体后失去其输导功能。

(2)伴胞 在筛管分子旁边有一个小而细长的薄壁细胞,和筛管相伴存在,称为伴胞。伴胞和筛管是由同一母细胞分裂再通过分化后形成。伴胞与筛管相邻的壁上有许多纹孔,有胞间联丝相互联系。伴胞细胞质浓,细胞核大,含有多种酶类物质,生理活动旺盛,筛管的运输功能和伴胞的生理活动密切相关,筛管失去功能后,伴胞将随着失去生理活性。

(3)筛胞 蕨类植物和裸子植物运输光合产物的输导分子,是单个的狭长的生活细胞,无伴胞存在,直径较小,两端尖斜,没有特化的筛板,只有存在侧壁上的筛域,不能像筛管那样首尾相连接,只能是彼此扦插靠侧壁上的筛孔运输,输导机能较差,是比较原始的输导结构。

(六)分泌组织

某些植物的一些细胞能分泌特殊物质,如挥发油、黏液、树脂、蜜液、盐类等,这种细胞称为分泌细胞,由分泌细胞所构成的组织称为分泌组织。分泌组织分泌的物质有的可以防止组织腐烂,帮助创伤愈合,免受动物吃食,有的还可以引诱昆虫,以利于传粉。植物的分泌物质有许多是常用中药,如乳香、没药、松节油、樟脑、松香等,有些可以作为中药的添加剂、矫味剂等,如蜜汁和各种芳香油。植物的某些科属中常具有特定的分泌细胞或分泌组织,在中药鉴别有一定的价值。

根据分泌细胞分布的位子和排出的分泌物是积累在植物体内部还是排出体外,常把分泌组织分为外部分泌组织和内部分泌组织。

1.外部分泌组织

分布在植物体的体表部分的分泌结构,其分泌物排出体外。

(1)腺毛 是具有分泌功能的表皮毛,常由表皮细胞分化而来。腺毛有腺头、腺柄之分,其腺头细胞被较厚的角质层覆盖,其分泌物可由分泌细胞排出细胞体外,而积聚在细胞壁和角质层之间,分泌物可由角质层渗出,或角质层破裂后散发出来。腺毛多存在植物于茎、叶、芽鳞、子房、花萼、花冠等部分。有一种可分泌盐的腺毛,由一个柄细胞和一个基细胞组成,常存在滨藜属一些植物的叶表面。

(2)蜜腺 是由一层表皮细胞及其下面数层细胞特化而成能分泌蜜液的结构。组成蜜腺的细胞壁比较薄,无角质层或角质层很薄,细胞质较浓。细胞质产生蜜液通过角质层扩散或经表皮上的气孔排出。蜜腺下常有维管组织分布,一般位于花萼、花冠、子房或花柱的基部,常又称为花蜜腺。具蜜腺的花均为虫媒花,如油菜、荞麦、酸枣、槐等。还有蜜腺分布于茎、叶、托叶、花柄处,称为花外蜜腺。如蚕豆托叶的紫黑色腺点,梧桐叶下的红色小斑以及桃和樱桃叶片基部均具蜜腺。枣、白花菜和大戟属花序中也有不同形态的蜜腺。

有些盐生植物,如矶松属的一些植物,其茎、叶具分布有排盐的分泌腺,柽柳属植物的表面有由几个分泌细胞组成的泌盐腺等。

2.内部分泌组织

内部分泌组织分布在植物体内,分泌物也积存在体内,常见以下类型。

(1)分泌细胞 是分布在植物体内部的具有分泌能力的细胞,通常比周围细胞大,以单个细胞或细胞团(列)存在于各种组织中。分泌细胞多呈圆球形、椭圆形、囊状、分枝状等,常将分泌物积聚于细胞中,当分泌物充满整个细胞时,细胞也往往木栓化,这时的分泌细胞失去分泌功能,作用就犹如贮藏室。由于分泌物质不同又可分为油细胞,如姜、桂皮、菖蒲等;黏液细胞,如半夏、玉竹、山药、白及等;单宁细胞,如豆科、蔷薇科、壳斗科、冬青科、漆树科的一些植物等;芥子酶细胞,如十字花科、白花菜科植物等。

(2)分泌腔 也称为分泌囊或油室,常发现于柑橘类果皮和叶肉以及桉叶叶肉中。根据其形成的过程和结构,常可分为两类:溶生式分泌腔,在基本薄壁组织中有一团分泌细胞,由于这些分泌细胞分泌的物质逐渐增多,最后终于使细胞本身破裂溶解,形成一个含有分泌物的腔室,腔室周围的细胞常破碎不完整,如陈皮、橘叶等。裂生式分泌腔,是由基本薄壁组织中的一团分泌细胞彼此分离,胞间隙扩大而形成的腔室,分泌细胞不受破坏,完整地包围着腔室,分泌物也存在于腔室内,如金丝桃、漆树、桃金娘、紫金牛植物的叶片以及当归的根等。

(3)分泌道 其形成与裂生式分泌腔相似,是由一些分泌细胞彼此分离形成的一个长管状间隙的腔道,周围分泌细胞称为上皮细胞,上皮细胞产生的分泌物贮存于腔道中。根据储存分泌物的种类进行命名,如松树茎中的分泌道贮藏着树脂,称为树脂道;小茴香果实的分泌道贮藏着挥发油,称为油管;美人蕉和椴树的分泌道贮藏着黏液,称为黏液道或黏液管等。

(4)乳汁管 是由一种分泌乳汁的长管状细胞形成,有单细胞乳汁管也有由多细胞构成,常可分枝,在植物体内形成系统。构成乳汁管的细胞主要是生活细胞,细胞质稀薄,通常具有多数细胞核,液泡里含有大量乳汁。现在研究证明,乳汁管的分泌物并非仅存在于细胞液中,也可存在于整个细胞质中,如巴西橡胶树。乳汁管分泌物常具黏滞性,呈乳白色、黄色或橙色。分泌物的成分很复杂,主要为糖类、蛋白质、橡胶、生物碱、苷类、酶、单宁等物质。

乳汁管分布在器官的薄壁组织内,如皮层、髓部以及子房壁内等。具有乳汁管的植物很多,如菊科蒲公英属、莴苣属;大戟科大戟属、橡胶树属;桑科桑属、榕树属;罂粟科罂粟属、白屈菜属;番木瓜科番木瓜属;桔梗科党参属、桔梗属等。乳汁管具有贮藏和运输营养物质的机能。根据乳汁管的发育和结构可将其分成两类:无节乳汁管,每一个乳汁管仅由一个细胞构成,细胞分枝,长度可达数米,如夹竹桃科、萝摩科、桑科以及大戟科的大戟属等一些植物的乳汁管。有节乳汁管,每一个乳汁管是由许多细胞连接而成的,连接处的细胞壁溶解贯通,成为多个细胞核巨大的管道系统,乳汁管可分枝或不分枝,如菊科、桔梗科、罂粟科、旋花科、番木瓜科以及大戟科的橡胶树属等一些植物的乳汁管。

二、药用植物组织培养技术

植物组织培养是指在自然条件下,将从植物体分离的器官、组织、细胞在人为控制的无菌等条件下使其能生长发育的一种技术和方法,是将现代生物技术应用在药用植物资源研究领域中的一个重要内容。从20世纪40年代我国学者罗士伟利用组织培养技术完成了石刁柏的离体茎尖繁殖,到今天已经有多种药用植物经离体培养获得成功,很多技术已经应用到生产实践中。

组织培养把从活植物体上切取下来的部分组织或器官叫做外植体。当我们把已分化的外植体组织中不分裂的静止细胞置于能促进细胞增殖的培养基上以后,细胞生理将会发生某些变化,使细胞进入分裂生长状态,这种由一个成熟细胞转变为分生状态的过程称为脱分化。一个成熟的植物细胞在经历了脱分化后,还能通过再分化而形成一个完整的植株,是因为这些细胞所具有全能性的特征,从理论上讲,任何一个具有完整的膜系统和一个完整细胞核的植物细胞,都具有形成一个完整植株的全部遗传信息,即使是已经过分化并高度成熟的细胞,也具有恢复到分生状态并继续完成新植株生长的可能。

广义的植物组织培养可以追溯到很早以前原始的植物扦插植树,剪枝培养。而现代组织培养的概念是生物技术研究领域的一项重要研究内容,包括了传统的组织培养,而发展更快更加引起人们注意的是细胞培养、原生质培养、原生质融合技术等。染色体工程、基因工程、克隆技术都与组织培养有密切关系,组织培养技术正以飞快的速度发展,广泛地应用在药用植物的资源开发和应用研究领域。

(一)植物组织培养的材料和条件

植物组织培养的材料几乎包括了植物的各种由活体细胞组成的组织。种子植物组织培养研究最为广泛,研究材料可采用根尖、茎尖、叶、叶芽、叶柄、花药、花粉、胚等部分。同一植株的不同部分在离体培养条件下的脱分化和再生能力是不相同的,植物的幼嫩部分比已经完全成熟的部分更适合于用做组织培养的起始材料。

不同的组织选用的方法不同,其培养的条件也不相同,包括对温度、光线、空气、酸碱度、渗透压以及灭菌条件等的要求。对于大多数植物材料,温度在20℃~28℃间即可满足生长需要。有些植物在暗培养的条件下生长较好,并且有利于次生代谢产物的合成,而在诱导器官分化时,则需要一定强度的光照。悬浮培养中的细胞旺盛生长需要大量的空气,需有良好的通气条件,而固体培养时一般不需要特殊的通气设备。多数植物的组织生长最适pH值是5.0~6.5,渗透压在1~2个大气压时可促进植物组织生长。

1.培养基

组织培养对培养基有着严格的要求,是能否使其成功培养发育的关键,到目前为止已经有百余种培养基用于不同药用植物的组织培养,虽然不同种植物对培养基的要求不同,但采用的化学合成的培养基大致有以下几类成分:

(1)碳水化合物 主要为蔗糖、葡萄糖、果糖类,其中以蔗糖最为常用。

(2)无机盐 除了碳、氢、氧外,还有氮、磷、钾、硫,以及钙、钠、镁等。

(3)微量元素 包括铁、铜、锰、锌、钼、钴、碘、硼等。

(4)维生素 包括烟酸、盐酸硫胺素(VB 1 )和盐酸吡哆辛(VB 6 )等。

(5)氨基酸 常用的是甘氨酸和水解酪蛋白等。

(6)植物激素 主要有吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和萘乙酸(NAA);细胞分裂素类物质有激动素(Kt)、玉米素和6-苄氨基嘌呤(6-BA)等。

不同组织材料的培养基配方不同,诱导细胞分裂、分化和维持生长的培养基也不相同。培养基中加入植物激素的种类和浓度在一定程度上决定诱导是否成功,在诱导生长和增殖过程主要通过不同激素的配比调控器官的发生。有些培养基还添加些天然产物,如果汁、酵母提取液、水解蛋白等。培养基中加入琼脂的固体培养基是一种普遍采用的方法。凡是不加入凝固剂的即是液体培养基,用液体培养基进行组织培养的方法称为液体培养。

2.植物组织的培养方法

植物组织培养技术发展很快,特别是植物细胞培养研究越来越引起人们的注意,如利用酶解或机械破碎等技术分离出单个细胞,再采用不同方法进行细胞繁殖,利用花药培养诱导形成单倍体植株,从体细胞分离出原生质体进行培养,使其再生、分化而发育成植株,利用种间原生质体融合而形成杂种细胞,进而分化形成杂种植株等。

(1)外植体的杀菌消毒 任何一个外植体的表面或内部都有存在微生物、真菌的可能,组织培养的准备工作包括杀菌和消毒,这是非常重要的一个环节。现在常用的灭菌剂有5%~10%NaClO,6%~10%H 2 O 2 ,0.1%吐温-20,0.01%~0.1%HgCl 2 等。此外,一些常见的抗生素,如阿莫西林、阿司匹林、庆大霉素等的溶液也表明有很好的杀菌消毒作用。

(2)愈伤组织培养 在无菌条件下,将从植物体上选用和处理好的组织块迅速培植在固体培养基上,在适宜的条件下,组织切口表面很快长一种经过脱分化后形成的薄壁组织块,称为愈伤组织。愈伤组织是植物组织培养和细胞培养的基本材料,植物的许多组织在适宜的条件下都能形成愈伤组织,如储藏薄壁组织、同化薄壁组织、维管形成层、根的中柱鞘、胚乳、子叶、叶肉组织等。将这种愈伤组织转移到含有促进细胞分化的培养基上,经反复的分裂和分化就能发育形成幼小的植株。在适宜的培养条件下,愈伤组织可长期传代,这种培养称为继代培养。

为了提高生长速度,在生产上常常选用液体培养方法,来代替含有琼脂的固体培养基,既悬浮培养。由于悬浮培养时营养成分可较快地渗入细胞体内等原因,可加快细胞的生长和分裂的速度,从而提高产量。因此愈伤组织不但是诱导形成植物的有效途径,也是加快植物代谢产物来源的有效方法。

(二)组织培养在药用植物资源中的应用

植物组织培养技术已经有近百年的历史,利用组织培养技术已经获得多种的试管植株,有些种的繁育技术已经应用到药用植物的种植生产中。

这项技术在药用植物资源研究和利用领域中的应用主要包括药用植物的育种、快速无性繁殖和有效成分的生产。

1.药用植物育种

(1)单倍体花药育种 根据单倍体的生殖细胞具有发育成一完整单倍体植株的潜在能力,利用花粉培育植株已被应用在多种药用植物的育种,可有效地缩短育种年限。花粉粒培养育种已经与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及与转基因技术相结合,形成一种新的育种技术体系,被逐渐应用到生产实践中。

(2)体细胞及体细胞杂交培育新种 通过人工诱导使不同种的体细胞原生质体融合,为有效地培育具有优良性状的药用植物新品种开辟了一条新的有效途径。

2.药用植物快速繁殖

药用植物快速繁殖是利用药用植物的芽、茎尖、愈伤组织、胚状体为培养材料,通过人工培养基并附加一定的植物激素诱导培养繁殖完整植株的一种方法,因常在试管中进行,也常称为试管繁殖。这种快速繁殖在生产实践中具有极大的应用价值和潜力。

有的药用植物不能依靠种子进行繁殖,还有的药用植物常规育种时间太长,如能利用组织培养的方法将大大缩短育种和生长周期。如中药贝母种子的繁殖率较低,利用组织培养的方法,繁育出3个月左右的鳞茎,其大小相当于用种子繁殖两年的鳞茎。人参生长周期较长,病害严重,常规育种困难,有人研究可利用体细胞胚胎发生的基本条件,不断筛选胚性组织进行继代培养,可保持绿苗分化的能力,发育成完整的植株。

3.药用植物的有效成分生产

植物体内各种有效成分的含量和质量是与其遗传特性、生长条件、收获时间以及贮藏运输等因素有着直接的联系。如能采用类似培养微生物生产抗生素的方法生产有效成分,将可利用人为的作用来控制有效成分的生产。因此利用组织培养方法生产药用有效成分,探索天然药物生产工业化的途径已经是当前中药生产研究的重要内容。目前,这方面的研究已取得了很大成绩。例如人参细胞培养的技术和规模目前都已达到一定水平,可通过组织培养获得活性人参细胞粉,除含有人参皂苷外,还含有天然人参所不具有的酶类和其他活性成分;培养的紫草细胞可直接用于制造口服或外用消炎剂,也可用于提取紫草素等。植物细胞培养生产的代谢产物是取之不尽,用之不竭的天然药物资源,目前植物细胞培养技术正处于快速发展阶段,已经对数百种植物细胞进行了培养研究,从中分离出多种次生代谢产物。

植物组织培养是生命科学研究中的一个重要内容,也是现代生物技术在植物资源领域研究、应用的一个重要组成部分。植物组织培养的研究从20世纪初期开始至今已有百年历史,我国从20世纪40年代初开始这项研究工作,至今已取得了丰硕的成果,同时,由于相关学科的迅速发展,促进了组织培养研究的技术、方法等不断更新,新的成果不断取得,充分表明了植物组织培养在基础理论研究和实际应用等方面都具有极为深远的意义和价值,不但为生物科学的研究提供了一条崭新的途径,并且为解决药用植物种质资源以及植物的代谢产物的研究和利用等开辟了有效的途径。

三、药用植物组织培养实例

实例1 地黄病毒病及脱毒培养

地黄 Rehmannia glutinosa Libosch为玄参科药用植物,多年生草本,别名酒壶花、山烟根、山白菜等。其新鲜块根或块根的加工品作为鲜地黄、生地黄和熟地黄,为大宗常用药材之一,为多种中成药的主要原料。全国大部分地区均可种植,其主要栽培品种大都集中在河南、山西、山东等地。日本等国也用赤野地黄 R . glutinosa var. purpurea 的块根作地黄入药。至今,地黄已有数百年的栽培历史,在生长过程中,易受多种病害侵袭,其中病毒病最为严重,通常田间感染率达100%。病毒在植物体内代代相传,致使地黄品种严重退化。早在20世纪60年代初田波就从地黄中分离到一种病毒,称为地黄退化病毒(DDV)。其后针对地黄病毒进行一系列研究,现就其脱毒培养的有关情况总结如下。

1.地黄病毒病的病症和表现规律

山东大学温学森等(2002年)于1997~2001年收集了河南、山东、山西、安徽和北京等各产区的不同时期的地黄栽培样本,在药用植物研究所种质园扩大繁殖,鉴定和区分不同品种,然后在完全相同的栽培和管理条件下,定时观察和记录各样本的生长发育情况,记录病毒病症状和变化情况。

(1)地黄病毒病的症状

①褪绿及黄化:黄化症状主要发生在叶片的叶肉部分,表现为叶肉不同程度的褪绿变黄,叶脉部分通常仍保持绿色,黄化部分和绿色部分无严格而明显的界限。褪绿症状在春夏之交表现明显,一般在春季形成的展开叶片上多见,边缘较轻,而主脉两侧和叶片基本比较严重。重症者,几乎整个叶片变黄,如“土绣”。

②花叶症状:花叶症状多发生于早春和初夏的幼叶上,表现为叶片黄色和绿色部分区别分明。黄色部分呈半透明状,明显较薄;绿色部分边缘清晰,通常占整个幼叶的一小部分,零星分布在叶脉之间,通常称为“绿岛”。在发病严重的植株中表现明显,故也称地黄病毒病为“花叶病”。

③畸形:叶片畸形是一种普遍的病症,主要表现为:褪绿及黄化的叶片,多向腹面突出,边缘多少向背面弯曲;初夏发育的幼叶,常较狭窄,皱缩或向一侧扭曲,不能正常伸展;叶片变形,如叶基部由缓慢下延变为皱缩下延;边缘锯齿增大,有的呈浅裂或两侧严重的不对称等,从而使整株矮缩。在部分野生类型中,有的花冠严重畸形,花冠筒扭曲,不能伸展开放或开放后畸形,有的仅花或花药伸出,栽培品种中尚未见明显的花冠畸形。

④泡状背突:泡状背突为新发现的一种病毒症状,主要发生在开展的叶片上,主要表现为位于侧脉之间的叶肉向背面凹陷,腹面绿色或深绿色,直径0.5~2.0cm,深0.2~1.0cm;背面观呈泡状,有光泽,多单独存在,也有相连者。

⑤黄斑:地黄叶片上局部出现的明显黄色斑块,呈不规则圆形或多角形,叶片厚度变化不明显,直径一般不超过0.5cm,分散在叶片上,但也见更大者或数个相连,具黄斑的叶片,一般叶片形状接近正常,早春和秋天均可形成,因此有地黄“黄斑病”之称。

⑥块根细小粗糙:地下症状比较明确的块茎不能正常膨大,产量严重下降。另外病毒病严重者,块根表面粗糙,河南产区称为“土锈病”。

(2)地黄病毒病症状的表现规律 感染病毒的植株,由于品种不同、病程长短、环境条件和病原种类的变化,所表现的症状多种多样。通常叶片呈现不同程度的花叶或黄斑、变厚、皱缩、畸形或变小;叶缘卷曲,有时枯焦;地下块根不能正常膨大,表面粗糙,商品等级下降。因此又有花叶病、黄斑病、卷叶病、土锈病之称。由于感染病毒,致使地黄严重减产,栽培上称之为“品种退化”。地黄的病毒病症状主要发生于幼苗期,即春季和夏初比较严重。夏初各种症状表现比较集中,夏末以后,随着新生叶片的出现,老叶片逐渐衰退枯萎,感病症状不明显。亦即地黄病毒病在夏季高温季节呈现一定的“隐症”。另外,不同的症状具有一定的表现时限。通常,春季的黄斑和花叶比较严重;暮春至初夏黄化、花叶、畸形等表现突出;夏季至秋季,泡状背突易见,春季形成的黄斑,这一时期依然明显;秋末收获时,膨大不良或表面粗糙的块根即可明显展现。研究者所观察的材料均经一株或少数长势相近的植株无性繁殖而来,但经过2~3年的栽培,病毒病的病症相差很大,反映了病毒与地黄之间相互作用的复杂性。栽培上,通常于7月份在田间选择病症较轻的进行倒栽留种,对病毒病的防治效果较好。这与地黄病毒病症状的表现时期是一致的,这一时期选择的优良植株,可能体内病毒浓度较低或对病毒产生了抗性。

2.地黄病毒病的病原

有关地黄病毒病的病原目前有不同的报道,或认为有一种,或证明为多数病毒复合感染。

烟草花叶病毒(TMV)或其一个株系或烟草花叶病毒属( Tobamovirus )成员:田波认为地黄退化病毒DDV近似于TMV,可能为TMV的一个株系。裴美云比较了DDV和几个其他来源的TMV分离物的寄主反应、体外抗性和血清学特征,进一步说明了DDV和TMV的区别。余方平等分离的TMV在寄主反应上仍有差别。

稍微弯曲的线状病毒:Lee首先报道从赤野地黄中分离到一种线状病毒,命名为地黄X病毒(Rehmannia X Potexvirus),大小为520nm×12nm,已被接受为马铃薯X病毒属( Potexvirus )的暂定成员;Matsumoto和余方平也分别分离到相似的线状病毒,但长达600nm,认为可能是香石竹潜隐病毒属( Carlavirus )的成员。

等轴状病毒:Matsumoto等首先报道了一种等轴状病毒;余方平等分离到两种:一种为黄瓜花叶病毒(CMV),直径27.5nm,另一种不明,直径19nm。

3.茎尖培养脱毒技术

茎尖分离和接种:从田间挖取当年种的地黄块茎洗净泥土,用70%乙醇表面消毒10s,再用0.1%HgCl 2 浸泡15min,然后再用无菌水冲洗5次,将带芽眼的部分切成小块儿放入1/2MS基本培养基中,待无菌苗形成2~3片绿色小叶时,取出小植株,在40倍双筒解剖镜下,剥取茎尖,使生长椎部分暴露,再用解剖刀切取茎尖,茎尖带1~2个叶原基,大小为0.1~0.2mm,将切下的茎尖迅速放到茎尖培养基上。

培养基及培养条件:适合地黄茎尖培养的培养基为:①MS+BA 0.5mg/L;②MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.02mg/L;③MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.02mg/L+GA 30.1mg/L;取在茎尖培养基上继代繁殖的脱毒苗(高4~5cm),去掉展开的叶子,分别为具茎尖和不具茎尖两部分,接种时两者相间排列,应用100mL锥形瓶,每瓶分别接种7棵。培养条件为23℃,光强度1500lx,12h/d。

茎尖苗的增值和诱导:为了进一步强壮幼苗,于接种后30天左右将茎尖苗移到MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L的培养基上增殖,促使其进一步长成苗,再过3~4周,取带两片叶子的基段进行生根培养,不同激素对茎尖苗的生根有着不同影响。从试验结果看MS+GA31mg/L可促进苗的生长,但小苗较弱,叶色较浅,无根形成,使用MS+PP3331mg/L可使小苗健壮生长,7天左右即可生根,发根快而多,叶色浓绿,移栽后较易成活。

实例2 芦荟的快速繁殖

芦荟 Aloe arborescens Mill是百合科(Liliaceae)芦荟属常绿草本植物,别名油葱,霸王蕉、草芦荟、象胆、龙角、番蜡。据文献报道,世界野生芦荟品种300多个,原产分布在非洲大陆250个品种以上,另外还有自然变异和人工杂交200多个品种。我国的云南、四川、广西、广东、福建等地都有栽培。芦荟的主要成分主要是芦荟素(aloin),为芦荟苷(barbaloin)及其异构体异芦荟苷(isobarbaloin)与β-芦荟素(β-barbaloin)的混合物,以芦荟苷为主。近年又分出抗癌药物β-芦荟素A,具有清肝热、通经、泻火、保健皮肤、增强免疫功能、抗溃疡、抗炎、抗肿瘤、增强免疫功能等作用。各种芦荟的有效成分含量及生物产量差异很大,除药用外并具有较高的的观赏价值,是集药用、食用、美容、观赏等于一身的热带植物。

(1)组培苗的培养 外植体的选取与处理:取一年生或多年生的无病植株的地上部分,去掉叶子,用75%乙醇擦洗茎段表面,在无菌条件下用0.1%HgCl 2 灭菌10min后用无菌水冲洗5次,每次3min,然后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分,再切成1~2cm的茎段待用。

不定芽的发生与增殖:①不定芽的发生:将处理好的外植体茎段转入诱导芽的培养基MS+BA4.5mg/L+IBA 0.2mg/L上,培养室温度控制在28℃±2℃,每天光照13~14h,光照强度为2000~3000lx,10天后幼芽培养基上的外植体腋芽开始变绿膨大,20天后顶芽、腋芽开始冒出,继而茎段周围相继萌发出多个不定芽,待不定芽长到1cm左右,将不定芽切割下,可增值3~5倍,经过不断培养,可继代繁殖出大量的不定芽。②丛生芽的诱导:芦荟在分化培养基中培养20~30天,在切口基部诱导出7~10个白色的小突点,继续培养数天后,小突起分化成绿色的丛生芽。但是,以MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L的培养基配方最好,增殖倍数是20~30天后丛生芽增殖的10倍,且形态正常易于分割,激素浓度过高时分化的丛生芽细小密集不易分辨。③增殖培养:丛生芽在分化培养基中培养30天后,在其基部有产生无数丛生芽,或先形成愈伤组织块,再在愈伤组织块表面分化出不定芽。不断重复切割丛生芽或不定芽的愈伤组织块转到分化培养基中培养,30天左右又分化产生无数的丛生芽,如此循环,就能达到快速繁殖的目的。

不定芽的生根:不定芽长高到1.5~2cm时,将不定芽切成单株,转接入生根培养基MS+BA4.5mg/L+NAA0.2mg/L+0.25%药用炭上,转移时要剔除苗和基部的愈伤组织和培养基,15天左右开始发生不定芽,30~40天可长成3~4株成簇、且有多条不定根的小苗。或者将4~5叶的丛生芽,在自然环境条件下炼苗7~14天后,直接切割植入腐殖土与细沙(3∶1)混合的基质中,保持空气80%湿度,20~30天后在切口基部产生3~5条根。

(2)炼苗及移栽 组培苗从培养基移栽到土壤中,这个转变要有一个逐渐适应的过程,因此必须炼苗,才能保证移栽后的成活率。①组织苗高达4~5cm,具有4~5条小根时,才能开始炼苗,否则组培苗太小,容易造成死苗。②先不揭开瓶盖,在室内自然条件下先炼苗3~4天,然后取出洗净组培养基部附着的培养基,切记伤根,如果培养基清洗不干净会引起细菌和真菌的繁殖,造成组培苗污染而死亡。移栽前应将移栽地和栽培基质用甲醛溶液的50倍液淋湿、覆盖,消毒一周,切记土质黏重渍水。移栽时,取出芦荟小苗,清洗干净根部培养基,用1000~2000倍稀释的高锰酸钾溶液浸泡全株1~2min。稍加晾干,将小苗移栽到营养袋中,营养袋用塑料薄膜制成,下有出水孔,底层为栽培土,上层覆盖河沙土,小苗植于沙中。③建造塑料薄膜大棚苗圃,有利于保温保湿,土壤基质为细沙为好,刚移出的组培苗不能栽在有机质多的肥沃土壤,以免造成真菌危害。④移栽后,保持土壤湿润,温度要控制在20℃~25℃,湿度不高于80%,光照以散射为好,成活率达95%以上。

(3)移栽后管理 移栽后应保持适宜的温度、湿度、光照等。一般可盖塑料薄膜调节温度至25℃左右。湿度可喷水进行调节,整个生长过程要求湿度不宜过大,以免造成烂苗。光照以自然光为好,用遮阳网调节。当幼苗长出新叶和新根后,可适当淡施一些液肥。

实例3 贝母的快速繁殖

贝母为百合科(Liliaceae)贝母属( Fritillaria L.)多种植物的鳞茎,有悠久的历史,是我国重要的中药材之一。据报道,目前我国贝母属植物有61种,50变种,5变型,按其临床功能分为两大类:川贝母和浙贝母,两者性能、功用大体相同,但临床应用却各有所长。川贝母和浙贝母都能清肺化痰而止咳,均可用于痰热咳嗽等症。但川贝母性凉且有甘味,兼有润肺之功,多用于肺热燥咳及肺虚久咳——虚证(现多用于肺结核、慢性气管炎等咳嗽);浙贝母苦寒较甚而偏于清肺,常用于风热、肺热咳嗽——实证(现多用于感冒咳嗽、急性上呼吸道感染、气管炎、肺炎之咳嗽),这主要取决于两者的品种来源有差异。川贝母的原植物种类复杂,主要有川贝母 Fritillaria cirrhosa D.Don.、甘肃贝母 Fritillaria przewalsskii Maxim.和梭砂贝母 Fritillaria delarayi Franch.,因主产于四川,故习称川贝母;浙江贝母为浙贝母 Fritillaria verticillate Willd.var. thunbergii Bak.因主产于浙江,故习称浙贝母,原产浙江象山县又称象贝。其鳞茎中含贝母碱(verticine,peimine)、去氢贝母碱(verticinone,peiminine)、贝母辛(pei-misine)、贝母芬碱(peimiphine)、贝母定碱(peimidine)、贝母替定碱(peimitidine)、贝母碱苷(peiminoside)和原贝母素(propeimine)等。

贝母可以用种子或鳞茎繁殖。如用种子繁殖,不仅困难,而且周期长;如用鳞茎繁殖,则用种量大而繁殖系数低。以浙贝母为例,如种一个鳞茎,只能收获1.5~1.6个鳞茎,仅有0.5~0.6个供药用。所以用组织培养方法繁殖贝母,具有较大的使用价值。

(1)外植体与培养基 外植体及其处理:浙贝母外植体使用最多的是鳞茎,采集鳞茎的时间与再生鳞茎的频率与数量有密切的关系。生根期采集的鳞茎再生频率为7.8%,出苗盛期为48.3%,开花盛期为15.9%,果实期为0.1%。苗期鳞茎培养2个月后再生的小鳞茎为原接种数的12.3倍,而生根期和花期再生的小鳞茎数分别为原接种数的6.8倍和5.3倍。以种胚为外植体时,培养基中要加GA3解除休眠才能形成愈伤组织。将贝母鳞茎洗去泥土,用自来水冲洗后,再用蒸馏水冲洗,滤纸吸干后,将鳞茎放置于70%或75%的乙醇中消毒,然后用滤纸吸干,再用0.2%升汞消毒10min,无菌水冲洗4~5次,切片接种。

培养基:贝母鳞茎多采用MS基本培养基。暗紫贝母鳞茎在MS培养基上的生长率明显高于在其他培养基上的生长率,分别为在B5、SH、67V培养基的1.52、1.57和1.67倍,且每升培养基增加的鳞茎鲜重和干重也是在MS培养基上增值最大,分别比位于第2位的B5培养基高出79%和58%。贝母其他种的培养也多采用MS为基本培养基,贝母鳞茎的诱导和生长需要较高的离子浓度。对暗紫贝母的研究表明培养基中蔗糖浓度为3%~5%时,鳞茎的生长率和生物碱含量较高,过高或过低的蔗糖浓度都会大大影响生物碱的合成。由此看来,相比于其他植物,组织培养贝母鳞茎所需要的蔗糖浓度偏高,这可能与贝母鳞茎中主要是淀粉,而淀粉的合成需要蔗糖的参与有关。培养基中添加酪氨酸和赖氨酸均可提高鳞茎的生长率,但不能促进生物碱的合成。

激素:贝母鳞茎培养常用的激素有2,4-D、NAA、IAA、KT和BA,不同种的贝母培养时所用的激素不同。生长素和细胞分裂素配合使用时,贝母外植体多直接再生小鳞茎,而当仅用生长素类激素时,常常是先形成愈伤组织,而后转入分化培养基上形成小鳞茎。对于处于休眠期的外植体在培养基中再附加一些GA3不仅能提高愈伤组织的诱导率,而且对生长也有良好的促进作用。

培养条件:对贝母的培养条件的研究不多,一般均采用20℃±1℃的散射光培养,培养温度较一般植物外植体低。对暗紫贝母研究的结果表明:20℃温度下,其平均生长率稍高于其25℃时的生长率,但明显地高于15℃时的生长率,15℃和20℃时的鳞茎中生物碱含量明显高于25℃时的生物碱含量。光照或黑暗培养对生长率影响不大。李隆云等(1995年)报道的暗紫贝母鳞茎再生时,培养室温度25℃±3℃,光照强度1000~1500lx,光照时间10~12h。

培养方法:贝母鳞茎培养大多采用固体培养,而液体培养的生长率比固体培养的高31%,在摇床上培养的暗紫贝母鳞茎每升培养基可产生生物碱8.005mg,比固体培养基高30%。平贝母的鳞茎愈伤组织、湖北贝母1个鳞茎的切片在固体培养基上可产生3~5个芽,最多7~8芽,而在液体培养基上则可产生是几个芽。这可能是由于在液体培养基上营养能够充分被吸收的缘故。

外植体再生小鳞茎的途径:外植体再生小鳞茎有3条途径:一是先形成愈伤组织,后由特化了的愈伤组织表皮层细胞经多次分裂发育成不定芽,如华西贝母、皖贝母、浙贝母;二是由外植体表面直接长出小鳞茎或小芽,如暗紫贝母;三是由组织表皮和内层一些特化了的胚性细胞经多次分裂发育成胚状体而形成小鳞茎,如伊贝母。上述第一、第二条途径较普遍,尤其是第二条途径,在短时间内可以得到大量鳞茎,而如以再生植株为目的,则应选择第三条途径。

(2)愈伤组织诱导与继代培养 在浙贝母中,用于诱导愈伤组织的培养基以MX+NAA1.0~1.2mg/L+KT 1.0mg/L+蔗糖4%+琼脂7%或MS+2,4-D 0.5~1.0mg/L+KT 1.0mg/L+蔗糖4%+琼脂7%效果较好。用15%CM代替上述培养基中的KT亦能较好的促进愈伤组织的生长。而暗紫贝母鳞片切片块在MS、B5、H培养基中均能诱导产生愈伤组织,其中以MS培养基的愈伤组织诱导率较高。实验表明,暗紫贝母对培养基具有较广泛的适应性。Robb研究无论外植体与培养基的相对位置如何,小鳞茎总是从近轴面发生。暗紫贝母鳞茎切块以上部切块愈伤组织发生率较高。不同生长时期外植体的鳞茎均能诱导愈伤组织,以一匹叶时期鳞茎诱导率较高。这可能与鳞茎的生活力有关。愈伤组织在含有NAA0.5~2mg/L或2,4-D 0.2~1.0mg/L的培养基中可以长期继代培养,并不丧失生长和分化能力。

(3)鳞茎的分化与完整植株的形成 将愈伤组织转移到MS+IAA2.0mg/L+BA4~8mg/L培养基上培养,则可由愈伤组织分化出白色的小鳞茎,并有根发生。报道暗紫贝母小鳞茎分化较适宜的激素配比浓度为IAA1.5mg/L+KT 0.05mg/L,其鳞茎诱导率为69.2%。所分化出的小鳞茎在形态上与栽培得到的小鳞茎并无区别。4个月内小鳞茎达到栽培条件下由种子繁殖所得到的2~3年生鳞茎的大小。

由组织培养再生的小鳞茎,在高温条件下因休眠而很难发芽。将这些小鳞茎置于低温(2℃~15℃)黑暗下放置2~3周之后,再转入常温光照下,则很快由鳞茎中央长出健壮的小植株。小植株移栽入土后,按照贝母一般的生长管理方法即可继续生长。

(4)组培贝母鳞茎生长特征与化学成分 组培贝母鳞茎生长特征和生物碱的累积:暗紫贝母鳞茎切块在培养基上经过20天静止适应阶段后开始恢复生长,30天后陆续从切口部位长出小鳞茎,经过20天后小鳞茎长成0.5~1cm,形状大小和野生贝母相似,培养50天后生长减慢并逐渐停止。从生长率变化情况看30~40天期间净增长0.688,40~50天期间净增长0.797,是增长最快的时期,50~60天净增长仅为0.22,60天以后营养已消耗殆尽,生长逐渐减慢。

从生物碱在整个培养期的积累看,从培养初期至后期始终保持在比较平稳的水平,这说明生物碱是伴随生长过程同步进行合成积累。从每升培养基可产生的生物碱的数量来看,暗紫贝母鳞茎组织培养以50天为合适采收期。

组培贝母鳞茎的化学成分:对卷叶贝母、湖北贝母、暗紫贝母组培鳞茎的研究表明:组培鳞茎与原种鳞茎有相似的生物碱和皂苷组成,且一般总生物碱含量比原种鳞茎高。如组培卷叶贝母鳞茎的生物碱含量平均值为0.75%,相当于原种鳞茎的2.6倍,总皂苷含量平均值为0.81%,相当于原种鳞茎的1.6倍。人体必需元素K、Mg、Ca等的含量在组培贝母中较高,而一些对人体有害的元素如Hg、Cd、As等检测不出或含量比原种鳞茎中的低。这表明通过组织培养进行贝母生物碱的生产是可行的,在短期内可以得到大量产物。但研究表明:生物碱的合成累积仅限于培养物组织内,而不能排入培养基,这表明贝母不适宜于固定化细胞培养的方法进行生产。

自从组织培养脱毒和快速繁殖技术问世以来,对脱毒苗木的发展和利用在世界范围内对农业、园艺、林木、包括药用植物的生产等均产生了巨大的影响并取得了可喜的成绩,在提高质量和产量方面已显示出极大的潜力。优良品种、新品种的脱毒组培苗大面积的推广和应用,有效地解决了因病毒引起的品种退化问题,直接产生了经济效益。组织培养脱毒和快速繁殖技术已得到愈来愈多的国家和地区的重视,正以突飞猛进的速度向前发展,并逐渐走向工厂化和商品化。

实例4 培养水母雪莲细胞产生黄酮类化合物

搅拌式生物反应器培养水母雪莲的操作程序如下。材料为经过筛选的水母雪莲 Saussurea medusa Maxium愈伤组织红色细胞系。培养基采用MS培养基,附加0.5mg/L 6-BA、2mg/L NAA、30g/L蔗糖、10g/L葡萄糖,高压灭菌前用1mol/L KOH调pH至5.8愈伤组织在500mL三角瓶中(装瓶量150mL)培养一段时间,作为生物反应器的接种液(种子)。培养期间采用日光灯连续照射,培养温度为25℃,摇床转速100r/min。

细胞大量培养采用的生物反应器为2L机械搅拌式生物反应器LH Series 210,England公司制造,工作体积1.4L。空气由空气泵通过转子流量计经由空气过滤器(Gelman ACRO 50,0.2μm)进入反应器。操作前反应器在121℃单独灭菌18min。待反应器冷却至室温,种子和培养液由顶部接口倾倒入反应器内,设置好通气速率和搅拌转速,温度自动控制在25℃±2℃。在反应器外用荧光灯和白炽灯照明。这种小型生物反应器培养细胞的目的是测定一系列影响培养物生物量和化合物产量的因素,以便确定正式培养时各种参数的最适数值。

(1)搅拌速度和通气量 植物细胞培养是一个需氧的过程,因此在放大过程中提供充足的氧对植物细胞的生长和代谢非常重要。在接种量2~3g(干重)/L、通气量700L/min时,分别采用不同搅拌速度培养水母雪莲细胞。转速在75r/min时细胞干重及黄酮产量达到最高,分别为11.4g/L和0.32g/L。

在转速为75r/min时,研究通气量对细胞生长的影响,发现在700~1000L/min时细胞生长良好。而低于300L/min或高于1000L/min时,细胞变褐,生长受到很大影响。与微生物相比,植物细胞需氧量较低。但由于植物细胞易形成聚集体,在高密度培养下容易使培养液黏度增大,因而影响了反应器内氧的传质和吸收。增大搅拌转速和通气量可以增加容积氧传质系数,加强溶氧,但过高搅拌速度和通气量会使培养细胞的次生产物产量降低。Smart等(1981年)在对长春花细胞培养中也发现类似规律,这是因为,一方面搅拌和通气促进了传质,但另一方面会增加剪切力对植物细胞的损害,同时造成培养体系内二氧化碳和乙烯等对细胞生长代谢有利气体的丧失和导致泡沫大量生成,从而抑制植物细胞生长和次生代谢产物的合成(Kim,1991年)。

(2)接种量对细胞和黄酮产量的影响 对不同接种量的研究发现,细胞接种量(以干细胞计)在4~5g/L的范围内,细胞生长良好,在这一范围内黄酮产量随接种密度增大明显增加。在低密度(<1.5g/L)培养时细胞增长几乎停止。而当接种量(以干重计)大于6g/L,细胞出现褐化死亡,黄酮产量出现下降。这些结果说明植物细胞培养在一定密度之上细胞生长才能启动,而接种密度过高使细胞培养物在高密度下培养,导致培养液黏度增大,引起氧和营养物质的传输受限,细胞会因缺乏养料而衰竭(Tanaka,1982年)。

反应器内细胞的最适接种量高于摇瓶的最适接种量(摇瓶一般为2.5~4.0g干重/L)。部分原因可能是因为由于通气的影响,导致许多植物细胞黏附成团浮在液面或粘在反应器中器壁、搅拌轴上。而这些黏附的细胞中黄酮含量只有19.3mg/g干重,明显低于溶液中的细胞。摇瓶中培养并不发生细胞的黏附,这可能是摇瓶培养的最适接种量高于反应器的原因之一。

(3)细胞生长和黄酮生物合成动态变化过程 水母雪莲细胞在2L机械搅拌式反应器培养过程中,细胞生长和黄酮合成的动态变化。在培养期间,搅拌转速和通气量分别维持在75r/min和700~1000L/min。细胞经过4天的延迟期后,第4~9天为对数生长期,12天时细胞生长达到高峰,最大细胞浓度(以干重计)达到13.8g/L,随后进入静止期,黄酮在细胞中的积累与细胞生长基本平行。可见,黄酮积累与细胞生长正相关,这与紫草宁的生物合成发生在细胞生长的静止期不同(董教望等,1993年)。在反应器培养中,黄酮产量在培养的第12天达到最高,为416mg/L。

(4)糖利用动态变化过程 从细胞对糖的利用可以看到,在培养的当天,初始蔗糖浓度有所降低,这是因为小部分初始蔗糖经过高温灭菌能分解为葡萄糖和果糖(Singha等,1987年)。培养开始后蔗糖浓度迅速下降,到第3天只有约5g/L,第5天后培养基中已检测不到蔗糖,葡萄糖在3天后才得到快速利用。培养基中蔗糖浓度的迅速降低在许多植物中被观测到,如白蓬草 Thalictrum rugosum Ait.(Kim,1991年)。Enaksha和Richard(1994年)根据对红豆杉细胞培养的研究认为,细胞在其表面分泌或含有过多的转化酶(invertase),导致蔗糖分解产生了大量单糖。

(5)聚集体分布 在悬浮培养过程中,植物细胞的一个重要特点是它容易形成聚集体。在水母雪莲细胞生物反应器培养过程中,反应器内聚集体分布随培养过程而发生变化,1~2mm的聚集体含量在培养后期明显增加,而2~3mm的聚集体含量却相应减少。这种聚集体分布与长春花细胞经反应器培养的分布相似(Toshiya等,1993年),即细胞聚集体分布集中在较小尺寸。通过比较12天时摇瓶和反应器细胞聚集体分布发现,摇瓶中1~2mm的聚集体含量低于反应器,其他部分则高于反应器。由于聚集体大小与黄酮合成密切相关,2~3mm和3~4mm的聚集体中黄酮含量较其他部分高,因此可以认为反应器培养产量下降的部分原因可能是由于剪切力作用使细胞聚集体分裂变小,不利于细胞生长和黄酮合成。 QI4/tzxilHSlB3KuWtU4X2kbbeICAKVi0G2b+DplxQurgVQ2ckD1E6DYAeI3wc0Z

点击中间区域
呼出菜单
上一章
目录
下一章
×