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第六节
人工制备抗体

抗体在疾病诊断、免疫防治和医学研究中发挥了重要作用,故对抗体的需求日益增加。人工制备抗体是获得大量抗体的有效途径。用抗原免疫动物,制备相应的抗血清,是早年人工制备抗体的主要方法。1975年,Kohler和Milstein建立的单克隆抗体技术,使规模化制备高特异性、均质性抗体成为可能。

一、多克隆抗体

多克隆抗体(polyclonal antibody,pAb)即抗血清中的抗体。大多数天然抗原分子中常含多种不同的抗原表位,每一种表位都可能刺激机体一个B细胞克隆产生一种特异性抗体。因此,当抗原物质免疫机体,可刺激多个B细胞克隆活化,产生针对多种不同抗原表位的抗体,称为多克隆抗体。获得多克隆抗体的途径主要有动物免疫血清、恢复期患者血清或免疫接种人群血清等。其优点:作用全面,具有中和抗原、免疫调理、介导补体细胞毒作用(CDC)、ADCC等重要作用;来源广泛,制备容易。其缺点:特异性不高,易发生交叉反应。

二、单克隆抗体

单克隆抗体(monoclona lantibody,mAb)是指由一个B细胞杂交瘤系克隆增殖的细胞群合成并分泌的针对同一抗原表位的单一抗体。解决多克隆抗体特异性不高的理想方法是制备针对单一表位的特异性抗体。Kohler和Milstein创立了杂交瘤细胞的单克隆抗体技术。通过致敏B细胞与骨髓瘤细胞融合制成杂交瘤(hybridoma),该细胞既有骨髓瘤细胞大量扩增和永生的特性,又有效应B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。

单克隆抗体制备的基本过程:用抗原免疫小鼠,再取脾脏制成细胞悬液(含有针对该抗原的致敏B细胞),与同系骨髓瘤细胞融合制成杂交瘤细胞,经克隆化分离扩增后,筛选出能产生相应抗体的阳性杂交瘤细胞,从而制备单克隆抗体。

三、基因工程抗体

基因工程抗体(genetic engineering antibody),又称重组抗体,是借助DNA重组技术和蛋白质工程技术,按人们意愿在基因水平上对抗体基因进行切割、拼接或修饰,重新组装而成的新型抗体分子。基因工程抗体的根本出发点是解决抗体的异源性问题,基本思路是制备部分或全部人源抗体的编码基因。①克隆到真核或原核细胞表达系统中,使其合成人鼠嵌合或人源化抗体。②转基因至剔除自身抗体编码基因的小鼠体内,主动免疫诱生人源抗体。其优点是部分人源化或完全人源的抗体,均一性强,可工业化生产;不足的是亲和力弱,效价不高。

基因工程抗体是拓展mAb广泛应用的重要思路。mAb多是来源于小鼠的鼠源性抗体,若用于临床对人体具有抗原性,利用基因工程技术将鼠源性mAb的可变区基因与人类抗体恒定区基因拼接,制备人鼠嵌合抗体(chimeric antibody),这样既可保持单克隆抗体均一性、特异性强的优点,又能克服其为鼠源性的不足。随着DNA重组技术发展,还可能制得部分甚至全人源化的基因工程抗体(genetic engineering antibody),如人鼠嵌合抗体(chimeric antibody)、改型抗体(reshaped antibody)、双特异性抗体(bispecific antibody)、小分子抗体及人源抗体等。

知识纲要

抗体(Ab)是B细胞受到抗原刺激后活化、增殖、分化为浆细胞,合成并分泌能与该抗原发生特异性结合的球蛋白。将具有抗体活性或与抗体结构相似的球蛋白统一命名为免疫球蛋白(Ig),即Ig是化学结构上的概念。

1.抗体的结构

(1)重链与轻链:抗体是由两条完全相同的重链(H链)和两条完全相同的轻链(L链),通过链间二硫键连接而成。

(2)可变区(V区)与恒定区(C区):①V区:H链和L链的V区构成抗体的VH-VL功能区,它是抗体与抗原表位结合的部位,V区中与B细胞表位呈互补结构,故称互补性决定区(CDR1、CDR2和CDR3),决定抗体的特异性。②C区:H链的C区与L链的C区分别构成抗体的CH1-CL、CH2、CH3或CH4功能区。抗体与抗原结合后,抗体构型发生改变,暴露其功能区,分别与补体C1q或吞噬细胞、NK细胞等 的相应受体结合,发挥各种免疫效应。

(3)铰链区:位于CH1与CH2之间,富含脯氨酸,有一定弹性。

(4)抗体的水解片段:①木瓜蛋白酶:将抗体裂解为2个完全相同Fab段和1个Fc段。依据木瓜蛋白酶水解片段来定义抗体分子的Fab段和Fc段名称。②胃蛋白酶:将抗体裂解成F(ab) 2 '片段和Fc'和若干小分子片段(pFc')。

(5)J链和分泌片:①J链:由浆细胞合成富含半胱氨酸的一条多肽链。可连接抗体单体形成二聚体、五聚体或多聚体。②分泌片:与二聚体IgA连接成SIgA,保护SIgA免受黏膜表面的蛋白酶降解。

2.抗体的多样性 ①可变区的多样性:针对不同抗原表位的抗体可变区的氨基酸残基序列显著不同,尤其是CDR。CDR是由胚系基因V、(D)、J基因片段随机重排和体细胞高频突变,形成抗体V区的多样性。②抗体恒定区的多样性:依据H链恒定区的抗原性不同将抗体分为5类,将由H链μ、δ、γ、α和ε的抗体对应命名为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,各类抗体的生物学特性显著不同;依据L链恒定区的抗原性不同,将抗体分为κ型和λ型,两型在功能上无差异。抗体有分泌型与膜型抗体两种存在形式,分泌型抗体是体液免疫应答的效应分子;膜型抗体多是B细胞抗原受体(BCR)成分。

3.抗体的抗原性 ①同种型:指同一种属所有个体的抗体分子共有的抗原特异性标志,可刺激异种动物产生抗同种所有个体同类抗体的抗体。②同种异型:指同种异体抗体的抗原特异性标志,可刺激同种异体产生抗异体同类抗体的抗体。③独特型:即抗体与抗原特异性结合的部位,是抗体V区特有的抗原特异性标志。独特型部位的抗原表位可刺激遗传背景相同的纯系动物、同种异体甚至自身产生抗独特型抗体(AId)。

4.各类抗体的特性 ①IgG:IgG以单体分子形式存在,是血液和胞外液中含量最高的抗体成分,为再次免疫应答的主要抗体,是唯一能通过胎盘的抗体。②IgM:突出特点表现为“三最”,产生最早(初次免疫应答的主要抗体),分子量最大(为五聚体),效能最高。③IgA:SIgA主要存在于外分泌液中,是黏膜局部免疫的主要抗体。④IgE:血清浓度极低,为亲细胞抗体,可直接与肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的高亲和力FcεRⅠ结合,引发Ⅰ型超敏反应。IgE也是抗寄生虫的主要抗体。⑤IgD:膜型IgD是B细胞分化发育成熟的标志。

5.抗体的生物学作用

(1)中和作用:抗毒素(抗体)与毒素结合,可以中和毒素的毒性;抗病毒抗体与病毒结合,中和病毒的感染性。

(2)激活补体作用:抗体(IgG和IgM)与抗原结合后,通过补体的经典途径激活补体系统,由补体系统发挥免疫效应。

(3)结合细胞表面Fc受体:①调理作用:IgG抗体与抗原结合后,与吞噬细胞的FcγR结合,可增强吞噬作用。②ADCC:IgG与靶细胞抗原结合后,与NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等的FcγR结合,杀伤靶细胞。③黏附作用:IgG与抗原结合后,与红细胞、血小板的FcγR结合介导黏附,有利于进一步清除抗原。④介导Ⅰ型超敏反应:IgE的Fc段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞FcεRⅠ结合,再与抗原结合后,引发Ⅰ型超敏反应。

6.抗体的人工制备 ①多克隆抗体:天然抗原含多个抗原表位,免疫机体,可刺激多个B细胞克隆活化,产生针对多种不同抗原表位的抗血清。②单克隆抗体:是指由一个B细胞杂交瘤系克隆增殖的细胞群,合成并分泌的针对同一抗原表位的单一抗体。③基因工程抗体:是借助DNA重组技术和蛋白质工程技术,按人们意愿在基因水平上对抗体基因进行切割、拼接或修饰,重新组装而成的新型抗体分子。 X9ZPLa/dI4YUyzHCagOv8IPbKTnNN73hEHJlwoqOJLTQo9787O6iZcP0RUILjlCo

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