第五节
蛋白质分离纯化技术

蛋白质是生命的物质基础，阐明蛋白质的组成、结构与性质可揭示其生物活性。研究蛋白质，首先需要将其分离纯化，比较常用的分离纯化技术是电泳、色谱和离心等。

一、电泳

蛋白质是两性电解质，在一定pH值条件下可以解离成带电粒子，在电场中向着与其所带电荷电性相反的电极泳动，这种现象称为电泳（electrophoresis）。带电粒子在电场中的移动方向和移动速率与粒子所带电荷量和分子大小有关。根据各种蛋白质在一定的pH值环境下所带电荷种类与数量不同的特点，利用电泳技术可以分离提纯蛋白质。根据支持介质，可分为薄膜电泳、凝胶电泳、毛细管电泳等，其中聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳应用最广泛。

（一）凝胶电泳

最常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳（agarose electrophoresis）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），这些支持物可以附于玻璃板上，PAGE还具有分子筛作用。人们常用十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）将欲分离的蛋白质分解为亚基，SDS是负电性很强的物质，它可使所有的亚基均带上大致相等的负电荷。这样，在具有分子筛作用的PAGE中，各种蛋白质的泳动速度仅仅取决于分子大小，这种电泳称为SDS-PAGE电泳。如有已知相对分子量的标准蛋白质作对照，此电泳可用于蛋白质相对分子量的测定。

（二）等电聚焦电泳

等电聚焦电泳（isoelectric focusing electrophoresis，IEF）在具有pH梯度的电场中进行的电泳，每种蛋白质有其特定的等电点，在pH呈梯度的电场中，按其等电点不同，带有不同的电荷，于是向与其带电相反的电极方向泳动。这样，在电泳时某一蛋白质迁移到电场中某一处的pH值等于其等电点时，该蛋白质便因不带电荷而停止泳动。这样，各种蛋白质按其等电点不同得以分离。

（三）双向凝胶电泳

双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DGE）是两种单向凝胶电泳的组合，即在第一向电泳后，再在其垂直方向上进行第二向电泳。如等电点聚焦/SDS-聚丙烯酰胺双向电泳，第一向等电点聚焦电泳是基于蛋白质等电点的不同进行分离，第二向SDS-聚丙烯酰胺电泳则按分子量不同进行分离，最终将蛋白质在二维平面上分开。

（四）毛细管电泳

毛细管电泳在内径为25～100μm的石英毛细管中进行。与普通凝胶相比，毛细管内径细，易于扩散热量。另外，毛细管电泳电阻大，在较高电压（可高至30kV）下仍可维持较小的电流，可以提高电泳分辨率并缩短分析时间。

二、色谱技术

色谱技术（chromatography）是分离生物大分子重要的技术之一，可以根据不同物质在固定相和流动相中分配系数的不同进行分离。

（一）离子交换色谱

离子交换色谱（ion-exchange chromatography，IEG）是指通过在固定相和流动相之间发生可逆的离子交换反应进行蛋白质的分离提纯。离子交换色谱所用的固定相介质称为离子交换剂，分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，其化学本质是一种引入了可解离基团的不溶性高分子化合物，如树脂、纤维素、葡聚糖等，其所含解离基团能与溶液中的其他离子进行交换。

以阴离子交换色谱为例（图2-19），将阴离子交换葡聚糖填入色谱柱内，由于此种葡聚糖颗粒本身带有正电荷，吸附溶液中带负电的蛋白质阴离子。若用带有不同浓度的阴离子（如Cl ^- ）溶液进行洗脱，洗脱液中的阴离子取代蛋白质分子与交换剂结合，低盐浓度时带电少的蛋白质被优先洗脱下来。随着洗脱溶液中阴离子浓度的不断升高，带电多的蛋白质也不断地被洗脱下来。若用不同pH值缓冲液进行洗脱，随着色谱柱内溶液pH值的变化，达到或接近其等电点的蛋白质由于不带电荷而被洗脱下来。这样，利用离子交换色谱，带电不同的蛋白质便得以分离。

（二）凝胶过滤色谱

凝胶过滤（gel filtration）色谱是指使样品随流动相经过固定相凝胶，样品中各组分按其分子大小不同而分离。凝胶色谱所用的固相介质是不带电荷多孔网状结构的填充惰性的微孔胶粒如交联葡聚糖，大分子物质不能进入网孔，不受固定相的阻滞，随流动相沿凝胶颗粒的间隙移动，移动速度快，首先被洗脱；小分子物质可以进入网孔，阻滞作用大，移动速度慢，后被洗脱（图2-20）。显然。凝胶具有分子筛性质，因而凝胶色谱又称为分子筛色谱。

（三）亲和色谱

许多生物分子的相互结合是特异和可逆的，如抗原和抗体、酶和底物、激素和受体等。亲和色谱是将抗体、底物或激素连接到固定相介质上，当相应的抗原、酶或受体随着流动相流过固定相介质时即可与之特异性结合，通过淋洗除去其他成分，再进行解离洗脱即可获得提纯物。亲和色谱法的纯化效率很高，一次可将蛋白质纯化千余倍。

三、其他技术

除上述技术之外，离心、透析、超滤等技术也是常用于分离提纯蛋白质的技术。

（一）离心

离心（centrifugation）是利用机械快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质分离开来的方法。随着离心技术的不断发展及离心装置的不断革新，离心机的最大转速不断提高，经历了从低速向高速、超速发展的过程。按每分钟离心转数（revolution per minute，rpm）可将离心分为低速离心（＜10000rpm）、高速离心（supercentrifugation，10000～30000rpm）和超速离心（ultracentrifugation，＞30000rpm）。

超速离心法既可用于分离纯化蛋白质，又可用于测定蛋白质的相对分子质量。蛋白质在高达50000g（g，gravity）的离心力下，可在溶液中逐渐沉降。

离心机的结构包括冷冻系统、真空系统、自控系统，分析用超速离心机还装有光学分析系统，可用于样品的定量分析。电子计算机自动控制程序的引入使得样品分子量、沉降系数及扩散系数等的测定自动化，为提高测定速度和测定结果的准确性创造了有利条件。

（二）透析

透析（dialysis）是利用半透膜将小分子与大分子分离的方法。透析时将蛋白质溶液装入透析袋内，然后浸入流动的缓冲液中，小分子就会从透析袋内透出，蛋白质因此得到纯化。透析过程中要更换3～5次袋外的透析液，以使透析袋内的小分子物质全部去除。有时将装有相对分子质量较大的蛋白质溶液的透析袋包埋入吸水剂如聚乙二醇等内，袋内的水与小分子物质可透出透析袋，达到将袋内蛋白质浓缩的目的。

（三）超滤

超滤（ultrafiltration）是在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的超滤膜时，相对分子质量较小的物质滤过，而相对分子质量较大的蛋白质被截留，从而达到分离纯化的目的。超滤常用于生物大分子，尤其是蛋白质的浓缩或脱盐。 pnmDUqvayY/jDZSflVp9bh/oXSMsYKH/Fl9NB1AbbReZa1WjAzqGN0aXPNyej0SY