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序言

在社会法律咨询服务以及法医精神病学鉴定实践中,由于应激所致法律纠纷以及抑郁症患者发生暴力犯罪的行为并不罕见。探索应激事件和抑郁症的病理基础,筛选安全、有效的精神药物,对于社会法律咨询服务以及法医精神病学具有理论价值和现实意义。

【研究假设】

压力对于大脑会造成器质损伤;

不同性别的大鼠在慢性应激抑郁模型中有不同的表现;

攻击行为可以在慢性应激抑郁模型中进行观察和研究;

不同治疗抑郁症的药物在同一基线模型中对于抑郁动物的行为、空间记忆以及大脑海马细胞的保护作用可能存在差异。

【研究方法】

本次动物研究设计为病例—对照实验。第一部分建立慢性应激抑郁模型及其对照研究。应激组由 10 只雌性Wister大鼠和 10 只雄性Wister大鼠构成,每天都要接受改良刺激。对照组由 10 只雌性Wister大鼠构成,不给予刺激。在建模前后进行攻击行为、糖水偏好、敞箱评分、体重变化以及水迷宫等测评。

第二部分实验中,把完成建模的 80 只Wister大鼠随机分成 8 组:(1)空白对照组,不给予任何的干预;(2 )蒸馏水组,每天定时灌胃 5ml蒸馏水;(3)舍曲林组,每天定时灌胃 7. 5mg舍曲林;(4)多虑平组,每天定时灌胃 15mg多虑平;(5)利培酮组,每天定时灌胃 0. 5mg利培酮;(6)阿立派唑组,每天定时灌胃 2. 5mg阿立派唑;(7)艾司唑仑组,每天定时灌胃 0. 3mg艾司唑仑;(8)群居组,每 5 只 1 笼饲养,不给予其他干预措施。在给药的第 7、第 14、第 21、第 28 天观察其攻击行为、敞箱活动、体重等变化。第三部分试验,在干预 28 天后,把大鼠统一处死,取脑、HE染色、Tunel检测海马细胞凋亡。

本研究所有数据应用SPSS11. 0 for Windows软件包处理。统计方法包括:

独立样本T检验;两两比较;多重比较使用Tukey法。结果以平均值±标准差

(Mean ± SD),T值,F值和P值表示。 P < 0. 05 具有统计学意义。

【研究结果】

第一部分:建立慢性应激抑郁模型及其对照研究

(1)敞箱活动和攻击行为得分结果

敞箱活动对照组与应激组比较,敞箱活动明显减少(F = -2. 012,P <0. 000 *** );雌性应激组比较对照组活动明显减少(P = 0. 001 ** );雄性应激比较对照组活动明显减少(P = 0. 031 * );攻击活动得分随着建模刺激减少,但是在刺激 14 ~ 21 天后,个别大鼠的攻击活动比较突出。

(2)水迷宫测量结果

建模前后比较,应激雌鼠在定向航行测定( T = -4. 493, P =0. 0001 *** ),空间探索测定(T = -5. 1176,P = 0. 03263 * )中的结果存在显著性差异。雄鼠在空间探索测定中,进入原来平台内环的次数有明显减少(T = 9. 271,P = 0. 0082 ** )。

在建模后,雄鼠和雌鼠在定位航行测定中表现出明显的差异( T =24. 680,P = 0. 00011 *** );在空间探索测定中也表现出了明显的差异( T =4. 968,P = 0. 000 *** )。

(3)糖水偏好测量结果

建模后,雌性、雄性以及对照组的 24 小时糖水消耗量比较,存在显著的差异(F = 0. 74,P < 0. 05 * );完成建模后,雌性大鼠比对照组 24 小时糖水摄入明显减少(T = -3. 78,P < 0. 001 *** );雄性大鼠比对照组 24 小时糖水摄入明显减少(T = -3. 62,P < 0. 001 *** )。

(4)体重测量结果

接受刺激的第 7 ~ 14 天,应激组比对照组,体重改变出现差异性( F =9. 2227,P = 0. 0003 *** )。其中雌性应激组比对照组,体重改变出现差异性(T = -4. 279,P = 0. 00028 *** );雄性应激组比对照组,体重变化出现差异性(T = -2. 981,P = 0. 011967 * )。接受应激的 14 ~ 21 天,应激组比对照组,体重改变出现差异性( F = 5. 4102,P = 0. 0075 ** )。其中雌性应激比对照组,体重改变有差异性( T = -3. 227,P = 0. 00612 ** );雄性应激组比对照组,体重变化出现差异性(T = -2. 526,P = 0. 0379*);接受应激的 21 ~ 28 天,应激组比对照组,体重改变出现差异性( F = 26. 429,P =0. 0000 *** )。其中雌性应激比对照组,体重改变有差异性( T = -6. 459,P = 0. 000 *** );雌雄应激组之间比较,体重改变出现明显差异( T = 4. 86,P = 0. 0001 *** )。

第二部分:不同药物干预后大鼠敞箱活动、攻击行为以及体重、水迷宫测试的变化

(1)敞箱活动(open - field)和攻击行为得分结果

敞箱活动(open - field)得分的结果比较发现:所有干预组,在不同时间内进行敞箱活动评分存在着显著性差异(F = 4. 9544,P = 0. 002221 ** )。其中,第 1 周到第 2 周,各组总体行为改变没有显著性差异。第 2 ~ 3 周,活动得分出现明显改变(T = 3. 403,P = 00424 ** )。在接受干预的第 4 周,活动得分与接受干预第 1 周活动得分存在显著差异(T = 3. 236,P = 00702 ** )。

各干预组在不同时间段,敞箱活动得分自身比较发现:艾司唑仑组干预前后,大鼠的活动评分存在显著差异(F = 5. 4205,P = 0. 003177 ** ),其中从干预开始,到干预后第 1 周的时间段内(P = 0. 04112 * ),从干预后第 1 ~ 2 周(P = 0. 00351 * )的时间段内,大鼠活动得分变化具有显著性;多虑平组从整个干预过程来看,可以显著的改变活动得分(F = 4. 2196,P = 0. 01104 * )。利培酮组在干预前后,存在行为活动得分差异(F = 3. 3008,P = 0. 02990 * ),其中,利培酮组第 3 周比第 2 周活动得分具有明显差异( T = 2. 77, P =0. 0404 * ),干预完成后第 4 周,比第 1 周活动得分有明显差异。(T = 2. 503,P = 0. 0446 * );舍曲林组在整个干预过程中,活动得分发生了显著性的变化。各个时间段比较后发现,舍曲林组行为变化第 1 周明显( T = 2. 667,P =0. 0448 * )干预结束后的第 4 周与第 1 周行为得分比较,有显著差异( T =1. 973,P = 0. 02071 * )。

干预一周以后,干预各组之间敞箱得分存在显著差异。(F = 5. 597,P <0. 0000 *** )。干预两周后,各组的敞箱活动得分有着显著性变化( F =3. 5075,P = 0. 0039 ** )。干预三周后,干预各组敞箱活动评分发生了显著变化(F = 3. 575,P = 0. 0038 ** )。干预四周后,干预各组敞箱活动得分出现显著变化(F = 3. 54,P = 0. 004 ** )。

敞箱活动得分的结果比较发现:在干预一周以后,总体上攻击得分存在显著异(F = 10. 395,P < 0. 000 *** )。对各组攻击得分两两比较后发现:多虑平组比艾司唑仑组攻击得分显著增加( T = 4. 712,P < 0. 001 *** )。多虑平组比阿立派唑组,攻击得分显著增加(T = 5. 498,P < 0. 001 *** )。多虑平组比空白组,攻击得分显著增加(T = -5. 812,P < 0. 001 *** )。多虑平组比群居组,攻击得分显著增加(T = -5. 655,P = < 0. 001 *** )。多虑平组比蒸馏水组,攻击得分显著增加(T = -5. 712,P < 0. 001 *** )。多虑平组比利培酮组,攻击得分显著增加(T = -5. 184,P < 0. 001 *** )。多虑平组比舍曲林组,攻击得分显著增加(T = -7. 532,P < 0. 001 *** )。其他各组之间的攻击活动得分两两比较,均未发现显著差异。

在干预两周后,总体上,第 1 周到第 2 周的时间内,各组的攻击得分有着显著性变化( F = 10. 395,P < 0. 000 *** )。两两比较后发现:多虑平组与利培酮组比较,攻击得分有显著性变化( T = -2. 655,P < 0. 05*)。多虑平组比较舍曲林组,攻击得分有显著性变化( T = -5. 812,P < 0. 001 *** )。在第 1 ~ 2 周时间段内,其他各组两两比较,未发现攻击行为的显著差异。

在干预三周和干预四周后,攻击行为分析没有发现显著差异。

(2)体重测量结果

蒸馏水大鼠不同时间段内体重变化存在显著差异( F = 10. 725,P <0. 0003062 *** );群居组大鼠不同时间段内体重变化存在显著差异( F =5. 6904,P = 0. 008032 ** );舍曲林组各个时间段内体重增加并没有发生明显变化;利培酮组各个时间段体重改变存在差异(F = 4. 4568,P = 0. 02020 * );多虑平组大鼠不同时间段内体重变化存在显著差异( F = 21. 388, P <0. 0001 *** );艾司唑仑组体重增加不同时间内比较,存在着显著差异( F =4. 3175,P = 0. 02250 * )。

不同时间段,对各种药物干预组、对照组之间体重改变两两比较发现:在干预后的 1 ~ 2 周,各组之间体重变化是具有差异性( F = 2. 6782,P =0. 01524 * )。在这个时间段里,多虑平组大鼠体重增加比阿立派唑组大鼠体重增加要明显(T = 3. 215,P = 0. 0377 * ),多虑平比较舍曲林组大鼠体重增加有差异性(T = -3. 201,P = 0. 0391 * );在干预后的第 2 ~ 3 周,各组之间体重变化也具有差异性(F = 3. 7532,P = 0. 001449 ** )。其中利培酮组比较艾司唑仑组体重增加有差异性(T = 4. 811,P < 0. 001 *** )。利培酮组比多虑平组体重增加有差异性(T = 3. 350,P = 0. 0257 * )。利培酮组与舍曲林组比较体重增加有差异性(T = -3. 654,P = 0. 0106 * );在干预后的 3 ~ 4 周内,各组体重变化有差异性(F = 2. 5759,P = 0. 01904 * )。其中,多虑平比蒸馏水组体重改变有差异性(T = 3. 508,P = 0. 0165 * )。

(3)水迷宫测试结果

定性航行结果:总体而言,干预可以显著的减少大鼠寻找、到达平台的时间(F = -3. 7915,P = 0. 0005104 *** )。空间探索测定结果:总体上而言,给予干预可以显著提高大鼠进入内环次数,对于改善空间探索能力是有效的(F = 6. 8562,P < 0. 0001 *** )。

第三部分:干预后大鼠海马细胞凋亡结果的比较

干预组与对照组比较,海马细胞凋亡明显下降。( F = -6. 0306,P <0. 0001 *** )。其中舍曲林组比较对照组,下降明显( F = -3. 962, P =0. 00202 ** )。利培酮组比较对照组,下降明显( F = -3. 256, P =0. 02238 ** )。在其他干预措施中,阿立派唑,多虑平,群居组对于细胞凋亡也有减少的作用,但是没有发现统计学上的显著性差异。

【研究结论】

1.雌、雄大鼠在接受 28 天的慢性应激后,均有体重增加变慢、活动减少、24 小时糖水摄入减少、空间探索能力下降等类似某些人类抑郁症的表现。其中,雌鼠与雄鼠比较,更容易表现出体重增加减少;雌鼠体重增加变慢出现的时间早于雄鼠。慢性应激后,雌鼠海马依赖的记忆和学习能力的下降比雄鼠更加明显。提示:雌性大鼠对慢性应激更为敏感。在今后的研究中,可以根据研究目的来选择大鼠的性别。

2.大鼠的攻击得分随着应激增加而减少。提示:抑郁症状加重,攻击活动总体减少,但是某些个体的攻击行为可能增加。

3.多虑平、利培酮、艾司唑仑可以导致抑郁大鼠体重增加。利培酮对抑郁大鼠体重的影响在干预早期,多虑平的影响出现在干预中期,艾司唑仑的影响出现在干预后期。药物对体重的影响,利培酮对体重影响大于多虑平;多虑平大于舍曲林和阿立派唑。

4.短期(7 天)的抗抑郁干预,不能改善大鼠敞箱活动。至少持续 2 周的抗抑郁干预,才能对大鼠活动产生明显的影响。利培酮、舍曲林、多虑平可以显著改善抑郁大鼠的活动。舍曲林改善活动出现效果较早,利培酮和多虑平需要给药 3 周以后出现明显改善。在干预早期,舍曲林改善抑郁大鼠活动的作用大于多虑平,而多虑平改善抑郁大鼠活动的作用大于阿立派唑。艾司唑仑可以减少抑郁大鼠的活动,尤其在给药的前 2 周明显。没有药物干预的抑郁大鼠,活动不能改善。

5.阿立派唑、舍曲林、多虑平可以显著改善抑郁大鼠的空间记忆。艾司唑仑可影响大鼠空间记忆。

6.利培酮、舍曲林、多虑平可以显著改善抑郁大鼠空间探索能力。艾司唑仑可能影响大鼠空间探索能力。

7.利培酮组海马细胞凋亡明显少于空白对照组;舍曲林组海马细胞凋亡明显少于空白对照组。提示:利培酮和舍曲林可以显著降低海马细胞凋亡。利培酮组的海马细胞凋亡明显少于艾司唑仑组;舍曲林组的海马细胞凋亡明显少于艾司唑仑组。提示:利培酮和舍曲林在降低海马细胞凋亡方面的作用,比艾司唑仑要好。

8.多虑平干预的抑郁大鼠,在干预的第 1 ~ 2 周容易出现攻击行为;比较后发现,多虑平组的攻击行为明显多于利培酮和舍曲林组。 2PQGBRHFymsYRUGllAGG9V6AYwxMOX2+C7voqEeaAVAcD6lmNWeDYZtgBBqaIP/9



1 前言

抑郁症是临床常见的情感障碍,是一种以心境低落为核心症状的综合征。其临床表现多样,部分患者还具有反复发作或慢性迁延的特征,目前已经成为危害人类心理健康的重要要精神问题之一。在社会竞争日趋激烈的今天,抑郁症的发病率有上升趋势。据世界卫生组织发表的《2001 年世界卫生报告》估计,抑郁症目前已成为世界第四大疾患,而到 2020 年则可能成为仅次于缺血性心脏病的第二大疾病。抑郁症已经成为家庭和社会的严重经济负担

应激障碍和抑郁症患者涉及法律问题并不罕见 。有研究表明,在法医精神鉴定的案例中,有较多的暴力犯罪抑郁症患者。负性生活事件导致精神损伤、相应精神伤害评定,以及精神赔偿等问题也是目前法学和法医学研究的热点 。结合大脑海马细胞损伤和心理解剖、常规法医解剖等方法来判断个体生前的精神状态,帮助进行死因推导,可以成为将来法医精神病学发展的一个方向。

关于抑郁症的发病机制至今不明,存在有诸多假说,例如单胺假说、受体假说、第二信使失衡假说等。这些假说虽然可以从不同的侧面对抑郁症的发生做出解释,但均不能全面彻底地阐明疾病的发生机制 。大量研究证实:抑郁症也是与应激密切相关的一类精神疾病。新近有研究发现,紧张的生活事件,尤其是慢性长期的压力与抑郁症,是一种剂量——反应关系。即不良的生活事件越多,抑郁症的发病率就越高 。目前发现,应激生活事件是抑郁症的明显促发因素并且认为慢性、低强度、长期的日常压力是引发抑郁症的主要原因。海马作为应激激素作用的靶区,是介导应激反应的主要中枢 。已有研究证实,海马神经元的凋亡、萎缩,海马神经祖细胞的增生调节,都参与了抑郁症的病理生理中 。通过研究海马来解释抑郁症的发病机制,以及抗抑郁药物起效机理,是一个很有前景的研究方向

建立抑郁症的动物模型,是深入开展抑郁症与大脑功能、结构关系的一个重要基础 。随着抑郁症应激理论的不断完善,相应的应激抑郁动物模型也得到发展。在动物身上制造抑郁疾病模型的方法很多。其中慢性应激模型其机理与人类抑郁症发病机理更接近,症状可持续相当长的时间,并且经过一定时间的抗抑郁剂治疗能使这些症状恢复正常。该模型与人类抑郁症发表与慢性应激有关的理论比较吻合 。使用慢性应激的方法建立抑郁动物模型在大量的科研中被采用。通过使用慢性应激诱导动物抑郁,使用抗抑郁症干预,可以进一步研究药物对抑郁症大鼠行为、对海马保护神经可塑性 ,以及对脑内传导机制的影响,是目前运用较多的一个研究方向

现有的众多建立慢性应激抑郁模型的研究中,较少有人在使用过程中考虑到了大鼠性别以及居住模式对于研究结果的影响 。治疗抑郁的药物有很多种,但是还很少有研究在同一个模型建立的基线水平上对常使用的精神类药物进行比较研究,不同的药物对于抑郁大鼠行为改善和海马细胞保护是否存在差异。通过探索这些问题,可以进一步了解性别在慢性应激导致抑郁症中的作用,也可以了解不同药物对于抑郁动物的不同效果。

新的神经生物学理论认为,成年哺乳动物海马等脑区神经元是可以由其祖细胞分裂而再生的。而抑郁症的发生与神经元再生障碍密切相关。在正常成年哺乳动物脑中,明显的神经元再生主要集中于嗅球系统和海马齿状回。海马作为学习、记忆以及引起情感障碍的关键脑区,每天有很多的新神经元产生 。已有研究证明,海马神经元再生在抑郁症的发病机制和抗抑郁症治疗有效机理中扮演者重要的角色 ,是抑郁症发生和恢复的重要因素。研究发现,抗抑郁治疗可以增加海马神经元再生,通过上调海马神经元再生可能逆转或阻止应激对大脑、尤其是海马结构及功能的损伤 。因此,抑郁症作为一种神经退行性疾病,神经元再生无疑为其治疗靶标的选择提供了一个新的视角。而通过促进海马神经元再生,恢复应激对大脑结构及功能的破坏就成为未来抑郁症治疗领域的目标之一

通过对现有文献研究报道进行分析,我们发现在建立常用抑郁动物模型,进行抗抑郁治疗效果机制研究的过程中,存在一些问题。并且,很少有研究者在自己的研究结果中对这些问题进行说明或者解释其局限性。

在这些研究中最常见的问题有:

1.动物种系的选择

从生物遗传的角度出发,动物种系之间存在着生理、心理的差异,这是可以肯定的。其实早在 1963 年,Okavnoto等人就已发现,Wister大鼠与其他鼠种相比,它在HPA轴和HPT轴两方面的反应性更高。在同等程度应激下,血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CORT)水平浓度更高,同时阿黑皮素原信使RNA(POMcmRNA)处于高表达状态 。也有其他的研究证实,SD鼠与Wister大素在强迫游泳中,Wister的不动时间则明显增长

但是目前很多研究设计中都选用SD大鼠作为试验对象,而不说明为什么选择SD大鼠;有的研究报告甚至没有说明选用鼠种的情况。故本研究将选择Wister大鼠作为实验对象,以求更好的达到研究目的。

2.动物性别的差异

抑郁症发病是有性别差异的。人类女性的抑郁症的发病率高于男性。最新的研究也发现,性激素对于海马神经细胞增生有一定的影响;实验动物在接受应激后,雌性海马神经元比雄性对于更容易受到损伤。但是,目前很多的研究设计中并没有重视到性别对于研究结果可能会带来的影响。很多研究文献采用了雄鼠作为研究对象,或者根本没有报道试验大鼠的性别。如果没有意识到这个问题,而把雌性动物和雄性动物的研究结果进行对等比较,将会发生对研究结论的错误解释。在慢性应激抑郁的大鼠模型中,不同性别大鼠接受相同的刺激后的不同表现,将在本研究中进一步探索。

3.抗抑郁治疗的多种药物在相同基线模型中进行比较研究的缺乏

抗抑郁药物很多,而在临床上治疗抑郁症患者时,我们常常合并使用了抗精神病药或者苯二氮 类药物。现在的研究设计通常都只一种或者两种抗抑郁药物进行干预后比较。在同一模型基线上进行多个常用治疗抑郁药物的研究试验还很缺乏,对于临床干预指导的意义有限。如果把不同实验室建立模型后给予干预所获得的结果进行比较,是不合适的。

4.攻击行为观察评分缺乏

对于抑郁症大鼠,目前较为统一的行为评分方法是敞箱活动评分。主要评价了大鼠的水平活动,站立和梳洗等活动的情况。有的研究中,也描述了在建立模型中大鼠出现激惹和攻击的状态,但是并没有对攻击本身进行量化评分。抑郁症患者出现暴力行为并不罕见,而且在临床抗抑郁治疗过程里,一些抗抑郁药物还可能引起激惹和运动性不安的不良反应。在本次试验设计中,设立了量化的攻击行为观测指标,对于更加合理和全面地观测应激所致的抑郁反应,以及药物对行为的影响,是有必要的。

5.药物干预设计中缺乏严格的对照

目前,有的研究将干预后的观测指标,与完全没有干预的对照组比较,并进行结果的解释;较少研究设计了安慰组对照。没有这个对照,就不能够充分说明,观测到的结果差异,是由于干预的药物,还是给药行为本身造成的。

6.干预效果与时间关系分析的缺乏

目前常见的研究模式是建立模型,进行干预,比较干预组与对照组的差异并评价干预的效果。那么究竟是什么时候干预开始发挥效果的呢?什么时候干预的效果是最明显的呢?

本研究针对以上的问题,主要在以下几个方面开展具体工作:

(1)设计了Wister雌、雄大鼠在接受相同的慢性不可预知应激后行为、体重等观测比较。

(2)对同一建立模型后的Wister雌性大鼠随机分组,分别给予①SSRI类抗抑郁药物,试验选择了目前研究较少的舍曲林。②三环类抗抑郁药物,选择了临床中较多使用的多虑平。③抗精神病药物,试验选择了临床上常常合并治疗抑郁症的利培酮。④抗焦虑的苯二氮 类,选择了艾司唑仑。⑤选用了新型抗精神病药物,阿立派唑。目前这个药物在临床的使用时间很短,对其是否适合治疗应激所致抑郁障碍可以进行探索。⑥群居对照:因为有研究证实丰富的生活环境,社会接触,可以促进海马细胞增生。⑦完全空白对照:改组建立模型成功后单独饲养,不给予任何的措施干预。⑧蒸馏水对照:用以区别干预药物产生的效果,是否与灌药行为有关。我们将在相同基线模型中比较这些常见的精神治疗药物对抑郁大鼠的行为改变和对大脑海马细胞的影响。

(3)增设了攻击行为的评分标准。

(4)对试验对象进行不同时间阶段的观察和研究,探讨干预—时间的关系。

技术路线如下图: 2PQGBRHFymsYRUGllAGG9V6AYwxMOX2+C7voqEeaAVAcD6lmNWeDYZtgBBqaIP/9

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