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红五军上了井冈山的消息，很快传至南京，引起了蒋介石集团的强烈不满。立刻撤换朱培德，委任鲁涤平为江西省省长，委任何键为“湘赣剿匪总指挥部”代总指挥，指令立即发动对井冈山第三次“会剿”。
实际上，湘赣两省敌军对红军和井冈山革命根据地进行第三次“会剿”计划蓄谋已久。自 7 月中旬第二次“会剿”破产后，即开始了策划第三次“会剿”的准备。据 1928 年 11 月 10 日的《申报》披露：“此次会剿计划，对于信号旗帜路线动作规定甚详，大致如下：（甲）会剿部队，赣省为 4 旅，湘省为 6 团。赣省部队，已经朱培德规定第五师第十四旅周泽源（此处有误，应为周浑元——编者注）、第十五旅刘士毅、第七师第二十一旅杨池生（此处有误，应为李文彬——编者注）、第十二师第三十五旅韦杵；湘省部队，经鲁涤平派定何键部 2 团、吴尚 3 团、第二军 1 团。（乙）会剿计划：刘士毅、杨池生（此处有误，应为李文彬——编者注）两旅由遂川向大小五井进剿，韦杵、周泽源（此处有误，应为周浑元——编者注）两旅由宁冈向井冈山进剿，何键部两团由桂东向江西大小五井进剿，吴尚部 3 团由茶、攸向井冈山进剿，第二军之 1 团由醴陵向攸县推进，为吴尚部预备队。（丙）会剿日期：由何键临时规定，惟各会剿部队统限于 11 月 10 日以前集中完竣，听候定期同时动员。”
11 月下旬，朱培德委任第七师师长王均、第十二师师长金汉鼎为江西“剿匪”正、副指挥，调集十四、十五、十九、二十一、三十四、三十五等旅，从吉安分路向宁冈、永新、莲花进攻。结果，因湘军鲁涤平积极性不高，未按原定计划出动，赣军历次“进剿”均为朱毛所败，心虚胆怯，不敢贸然深入，故 11 月拟订的“会剿”计划未能实现。
12 月下旬，鲁涤平就任湘赣两省“会剿”总指挥、国民党江西省政府主席，随即派代表唐希汴赴湘敦促何键就任湘赣“剿共”总指挥部代总指挥，迅速出师“会剿”。1929 年 1 月 1 日，元旦伊始，湘赣“会剿”总部在江西萍乡成立，何键宣誓出任代总指挥，金汉鼎为副总指挥，确定 6 旅人马计 18 个团，分 5 路向井冈山扑来。其兵力部署为：第一路为赣敌李文彬的第二十一旅和刘士毅的十五旅，分别驻遂川和赣州，李文彬为司令；第二路为张兴仁的第三十五旅和周浑元的三十四旅，驻泰和、永新一线，张兴仁为司令；第三路为湖南王捷俊部 3 个团，驻江西的莲花，王捷俊为司令；第四路为吴尚部 1 个旅，驻酃县、茶陵，吴尚为司令；第五路为刘建绪部，驻湖南的桂东，刘建绪为司令。何键命令各路部队于 1 月 10 日前进入指定地点，实行层层包围、步步紧逼、最后合围之策，一举消灭朱毛红军，荡平井冈山
。
敌人“会剿”的消息很快传到了边界红军总部。毛泽东、朱德、陈毅、彭德怀、滕代远等都感到事态的严重。当时红军充其量不过四个团。面对强敌压境，1929 年 1 月 4 日至 7 日，前委、特委、红四军和红五军军委、各县县委、团特委在宁冈县柏路村横店召开联席会议，毛泽东主持大会。与会人员发生了激烈争论，有的主张凭险死守，有的主张到湘鄂赣去，有的主张到湘南去，有的主张到赣南去。毛泽东在冷静分析形势后指出，在当前敌我力量悬殊的情况下，凭险死守于我军不利，且敌来势汹汹，加上寒冬季节已到，我军物资菲薄，虽有群众援助，也难以取胜。但是井冈山革命根据地又不能放弃，要保住经营年余的井冈山根据地这块红色政权，不能死守，必须采取积极的行动，钻敌人的空子。敌人从这边打来，我们就从那边打出去，迂回敌后，使敌人穷于应付，求得在外线消灭敌人的有生力量，打破敌人的“会剿”
。会议最后决定采取毛泽东的主张，由彭德怀、滕代远领导红五军和红四军三十二团等守山，毛泽东、朱德则率红四军主力下山，出击赣南，吸引敌人，实施“围魏救赵”之策以解井冈山之围。
1929 年 1 月 14 日，红四军主力 3600 余人，在毛泽东、朱德率领下，兵分两路从茨坪、小行洲出发，冒雪向赣南出击。一年来朱、毛红军的深情，让井冈山人民深深感到了革命的利益所在，井冈山的人民舍不得红军离开。下山的那天，红五军、红三十二团的指战员，及山上山下的群众近千人冒着纷飞的大雪，自动地站在路的两边，为红四军主力部队送行。送行的群众将带来的熟蛋、布鞋、烟叶等，一一往战士们的荷包里塞。战士们拉着老表们的手，谁也舍不得分开，场面异常悲壮动人。
红军主力离开后，彭德怀、滕代远、张子清、何长工、王佐等领导守山军民，对坚守井冈山作了周密的布置。以李灿率红五军第一大队、徐彦刚带领的红三十二团一连防守黄洋界，抗击湘敌王捷俊部；贺国中率第八大队和宁冈赤卫大队一部防守桐木岭的白泥湖阵地；黄云桥率第九大队扼守桐木岭的梨坪，抗击赣敌周浑元第三十四旅和张兴仁第三十五旅之一部；彭包才率第十大队和教导队一部扼守八面山，抗击湘敌第八军吴尚部；黄龙率第十二大队及酃县赤卫大队、遂川赤卫大队一部把守双马石哨口和荆竹山一线；王佐率三十二团二连和遂川赤卫大队一部担任朱砂冲哨口的防守任务，抗击李文彬第二十一旅之一部和反动地方武装。同时，动员山上军民在上述五大哨口加固工事，在哨口前面筑起一道道竹钉阵，筹集粮食，运送弹药，抢护伤员，为保卫井冈山军事根据地做好军事和物资上的准备。
红四军主力下山后，何键即令进至遂川的第一路李文彬的第二十一旅、进至资兴的第五路刘建绪部，会同赣州的刘士毅第十五旅，向赣南追击红四军主力。命令进至永新一线的第二路张兴仁第三十五旅、周浑元第三十四旅，进至莲花的第三路王捷俊部一个团，进至酃县、茶陵一线的第四路吴尚部一个旅，向井冈山逼近，紧缩包围圈。1929 年 1 月 27 日至 29 日，湘赣两省敌军 10 余个团，向黄洋界、八面山、桐木岭三大哨口发起猛攻。面对敌人的步步进逼，守山部队在彭德怀、滕代远、何长工等领导指挥下，同敌人进行了三天三夜的浴血鏖战。守卫八面山哨口的 100 多名红军指战员全部壮烈牺牲。攻打黄洋界哨口的敌兵，收买了一个游民，沿着他平时捉石蛙的一条小溪，插进了小井村，烧毁小井红军医院，并直取黄洋界，致使黄洋界哨口腹背受敌。守卫黄洋界哨口的官兵，在李灿、徐彦刚的率领下，解下绑腿，砍来葛藤，结成长绳，滑下悬岩，退入深山。随后，敌人直逼茨坪。情况异常危险。彭德怀、滕代远只得招拢剩余的守山部队，约 500 余人，沿着朱砂冲不足一尺宽的悬岩小道，在荆竹山集合后，向南突围。
敌人占领井冈山军事根据地后，2 月又调集赣敌第五师第十四旅、第十二师第三十五旅计四个团的兵力，向九陇山军事根据地发动了猛烈攻击。坚守在九陇山的永新、莲花、茶陵县赤卫大队，在刘作述、鄢辉等指挥下，凭险抵抗，然终因寡不敌众，丢守阵地。至此，第三次反“会剿”失败了。但彭德怀、滕代远等领导指挥下的守山部队在战斗中表现出来的顽强不屈的精神，是非常可贵的。同时，由于红五军等守山部队在坚守井冈山的过程中，拖住了敌人，也为红四军出击赣南赢得了时间，创造了条件。
红四军主力离开井冈山后，在毛泽东、朱德带领下，沿着羊肠小道，冒着风雪疾进，部队经遂川大汾、左安，在大汾歼灭前来堵截的一营敌人，跳出敌人的重围后，于 1929 年 1 月进入赣南地区的上犹、崇义地区，在敌军的追击下，迭遭失利，几乎陷入绝境。1月 22 日，红四军攻击大余县城，24 日，敌李文彬旅围攻大余县城，与红四军展开激战，红四军由于长途跋涉，兵马劳顿，仓促应战，伤亡很大。为突出重围，红二十八团党代表何挺颖身负重伤，几天后夜行军时突遭敌袭，何挺颖从马上摔下牺牲。独立营营长张威亦不幸牺牲。离开大余后，部队折向信丰、全南、龙南、定南以及寻乌等地，在寻乌项山，又与刘士毅部交手，由于仓促突围，朱德妻子伍若兰为掩护军部转移，腿部受伤，不幸落入敌手，受尽折磨后，坚贞不屈，壮烈牺牲，年仅 23 岁。部队的连续失败，损兵折将，使毛泽东、朱德感到十分困惑和痛苦。为了扭转战局，2 月 10 日，红军主力折回瑞金大柏地，此时，赣敌刘士毅仍紧追不舍。为了摆脱追敌、鼓舞士气，毛泽东、朱德决定利用大柏地的有利地形，痛击刘士毅部。部署停当后，部队进入阵地，至下午 2 时左右，敌刘士毅部进入红军的伏击圈。战斗打至傍晚，终于将敌人打垮，歼敌1500 余人，生俘 800 余人，振奋了军心，这是红四军转战赣南以来的首次大捷。随后进入到吉安东固地区。1929 年 2 月 20 日，与李文林等领导的江西红二、四军团在东固螺坑胜利会师，休整了非常宝贵的一个星期。
在东固，毛泽东、朱德等闻知井冈山失守的消息。毛泽东、朱德及红军将士都甚感沉痛。这时，赣敌李文彬部正向东固逼近，金汉鼎部也向东固取进击之势，于是，毛泽东根据东固前委会议的决议，放弃原定的固定区域的公开割据政策，采取变幻不定、变定不居的“打圈子”游击政策，离开东固，出击赣南、闽西。毛泽东、朱德的这一决策，不仅使红四军从而走出了低谷，而且为开创赣南闽西革命根据地，形成中央革命根据地打下了坚实的基础。
2 月 25 日，红四军离开东固，经永丰、宁都、广昌，再折至瑞金壬田。3 月上旬，红四军挥师入闽。3 月 14 日在长岭寨与敌郭凤鸣一战，大获全胜，并击毙了闽西土著军阀郭凤鸣，随即占领汀州。在汀州，红四军补充了大量军需，并在汀州附近对红四军的组织系统进行了改编，将部队编成了三个纵队，尔后回师赣南。4 月 1 日，红四军回到瑞金，与先期到达瑞金的红五军会合。
4 月 3 日，前委在瑞金收到了中央的“二月来信”。中央的这封信是 2 月 7 日发出的。这封信，向红四军前委介绍了当前的国际国内形势，着意强调了城市工作的重要性，对在农村的红军前途作了较为悲观的估量。来信提出红四军必须分成小部队的组织，“散入湘、赣边境各乡村中进行和深入土地革命”，以“避免敌人目标的集中和便于给养与持久”，并提出朱德、毛泽东“离开部队”，“速来中央”
。毛泽东认为“‘二月来信’的精神是不好的”，为此专门召开了前委会议。前委会上绝大多数同志都深有同感，不同意朱、毛离开部队，并要毛泽东代表前委给中央复信。4 月 5 日，毛泽东代表前委在复信中以红四军的切身体会，说明了分兵游击的危害，并提出了一年争取江西同时兼及闽西浙西的计划。同时，提出如要朱、毛离开部队，请中央派刘伯承、恽代英两人来接替，以利工作
。
中央收到此信后，在周恩来的努力下，没有坚持原议，朱、毛因此也没有离开红四军。4 月 11 日，前委又在于都召开会议，会后，红五军返回井冈山收复失地，红四军在赣南分兵，开始了新的斗争。
但是，随着斗争的深入，红四军党内的无产阶级思想与非无产阶级思想的分歧，愈来愈明朗化，加之红军处于初创时期，红四军党内对党和军队建设的许多问题认识不一致，由此产生了激烈的争论。争论的主要问题为：一是关于党对军队的领导问题；二是关于民主集中制问题；三是关于反对军阀主义残余问题；四是关于建立根据地问题。这些争论的焦点，后来集中在“要不要设立军委”的问题上。对此，朱、毛意见不一，毛泽东的有红四军前委，不再设立红四军军委的主张没有得到多数人的认同。为此，毛泽东提出“坚辞”前委书记，并在 6 月 14 日复信林彪，认为争论的实质是“军党部要不要的问题”，是“一个很严重的政治路线问题”，是“少数同志错误路线的结穴”
，但未能在前委取得共识。
1929 年 6 月 22 日，红四军前委在福建龙岩召开红四军党的“七大”，试图以会议的形式解决红四军党内的争论问题。会上，虽然毛泽东不要设立红四军军委的主张占了上风，但最后在选举红四军前委书记时，陈毅当选，毛泽东落选。
毛泽东在红四军党的“七大”落选前委书记后，离开领导岗位，到福建的蛟洋一带隐居养病读书，历时五个月之久。其间，陈毅去上海参加军事会议，并向中央实事求是地汇报了红四军的工作。主持中央日常工作的李立三和主持中央军委工作的周恩来，表示支持毛泽东回红四军前委主持工作，并于 1929 年 9 月 28 日发出《中央给红四军前委的指示信》，明确提出毛泽东“应仍为前委书记”。毛泽东获悉中央“九月来信”的精神后，欣然于 11 月 26 日回到红四军任前委书记。
1929 年 12 月 28 日，红四军“九大”在福建龙岩古田召开。由于有中央“九月来信”的指导，有毛泽东的正确领导及朱德、陈毅的协同努力，会议取得了令人满意的效果。大会统一了思想，一致通过了《中国共产党红军第四军第九次代表大会决议案》（即古田会议决议）。大会最后改选了红四军前委，毛泽东当选为书记。
1929 年末，红四军第一纵队司令员林彪给毛泽东写了一封《新年贺信》，提出“中国革命的高潮未必很快到来”等重重疑虑。针对来信，毛泽东在福建古田赖坊写了《时局的估量与红军行动问题》的长篇党内通讯（即《星星之火，可以燎原》），于 1930 年 1 月 5 日答复林彪，不仅尖锐批评了林彪等人没有建立红色政权的错误观念，而且更为重要的是提出了党的工作重心应该放在农村而不应该在城市的思想，构建了中国革命农村包围城市的理论框架。
井冈山失守后，敌人对根据地实行了惨无人道的“石头要过刀，茅草要过火，人要换种”的血腥政策。根据地边界各县的党的组织遭到严重破坏。为了恢复边界工作，1929 年 2 月，边界特委委员兼特委巡视员宛希先来到九陇山，召集宁冈、茶陵、永新三县党的负责人，召开联席会议，成立了中共湘赣边界临时特委，以朱昌偕为书记，统一领导边界斗争和收容整理工作。临时特委成立后，经过艰苦的斗争，永新、茶陵、宁冈等党组织得到一定的恢复健全，于 3月 14 日召开了边界特委扩大会议，又产生了新的临时特委，仍以朱昌偕为书记，边界的各项工作又出现了勃勃生机。
1929 年 3 月，蒋桂战争爆发，“会剿”占领井冈山的敌军被调往前线。1929 年 4 月底，红五军在彭德怀、滕代远的率领下，奉前委的命令，重回井冈山。红五军的归来，使边界工作力量顿增，先后收复了遂川、宁冈两县城，取得了安福战斗的胜利，攻克了永新县城。攻克永新后，中共湘赣特委由大湾村迁至永新城。
1930 年初，江西红军独立二、三、四团合并，组成中国工农红军第六军，（不久改为红三军），黄公略任军长，刘士奇任政委（后为陈毅），下辖三个纵队。然而，在革命形势好转和繁重的政治任务面前，赣西党内一部分同志，却在时局的估量和行动上产生了分歧。为此，红四军前委于 2 月 6 日至 9 日，在吉安陂头（现青原区渼陂村）召集红四、五、六军委和赣西、赣南、湘赣边界特委联席会议，史称“二七陂头会议”。陂头会议讨论了赣西南党的任务，确定了攻取吉安的行动目标和战略部署，通过了《二七土地法》，产生了统一领导军队和几块根据地的领导机关——前委，毛泽东为书记。
几乎与此同时，因受“左”倾错误的思想影响，在井冈山坚持斗争的袁文才、王佐被错杀。早在 1929 年 1 月柏露会议期间，毛泽东召集相关人员开了一个小范围的会议，就中共六大决议案中关于“杀戮土匪首领”问题进行了讨论，毛泽东主张具体情况具体分析，不能杀袁文才、王佐，得到与会同志的赞成
。1 月 14 日，在红四军主力出击赣南前，前委和毛泽东调袁文才为红四军参谋长，随红四军出征。2 月下旬，袁文才在随红四军向赣南进军的途中，发现了中共六大决议案中关于“杀戮土匪首领”的内容，极为恐惧，未向毛泽东、朱德请示就私自离队，返回了宁冈。中共宁冈县委给了袁文才一个“党内警告”的处分，让他担任了宁冈县赤卫大队大队长。
袁文才是宁冈客籍革命派首领。他的归来，引发了土籍革命派龙超清等人的强烈不满，激发了土客籍之间的矛盾。1930 年 1 月下旬，在中央巡视员彭清泉的指导下，湘赣边界特委、赣西特委、红五军军委在遂川县于田召开联席会议。会议根据中共“六大”决议案的精神，作出了武力解决袁文才、王佐部队的决定。
1930 年 2 月 24 日拂晓，红五军抽调一个纵队从安福至永新，暗中包围了袁文才、王佐部队，边界特委书记朱昌偕等人闯入袁文才的房间，将尚不知情的袁文才打死在床上。王佐听到枪声，立即率其心腹刁飞林等骑马向宁冈方向逃跑，不料通往宁冈的浮桥已被特委事先拆断，不会游泳的王佐等被淹死在永新城东关潭里。袁、王部下被打死淹死骨干 40 余人，从此袁、王部队不复存在。
从 1930 年 4 月底至 9 月初，赣西南特委在红军主力远离赣西的情况下，组织其他红军及地方武装，在数十万群众支持配合下，连续 8 次攻打吉安，虽然由于武器装备太差，没有夺取吉安城，但赣西红色区域却扩展到 30 余县，使吉安城成为了红色海洋中的一座孤岛。10 月 4 日，毛泽东率领红军主力从湖南长沙回师吉安，在工农群众的配合下，发起“九打吉安”战役，一举攻克了吉安城。
1930 年 11 月 7 日，毛泽东从峡江到吉安布置撤退，准备第一次反“围剿”，途经吉水县东塘村、大桥村，吉州区李家坊村、西逸亭村，写下了《东塘等处调查》。11 月 21 日，毛泽东从吉安前往永丰，途经吉水县木口村，写下了《木口村调查》。这两个调查，都是毛泽东利用短暂的休息时间，就二七陂头会议后，土地斗争开展的情况所做的。
红军攻克赣西南重镇吉安，使整个赣江中段和南段连成了一片。此时，赣西南苏区东起江西的吉安、泰和、遂川，西至湖南的茶陵、酃县，北至江西的萍乡、宜春、新余一带，南至赣州的上犹、崇义山区，使湘东南苏区与赣西南苏区连成了一片，建立了以永新为中心的湘赣革命根据地。与此同时，以瑞金为中心的中央革命根据地开始崛起。
井冈山革命根据地是以毛泽东为代表的中国共产党人在艰苦卓绝的斗争中不断探索武装斗争、土地革命、根据地建设，寻找中国革命道路的过程中创建的。在这个过程中，中国共产党人对中国革命所面临形势有了进一步的了解，对中国革命道路的发展有了更清晰的认识，并在实践中推动了马克思主义中国化，这成为井冈山精神的重要实践基础。也正是这种实践，才有了井冈山精神的产生。