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摘要 ：板栗营养价值很高，甘甜芳香，含有丰富的淀粉。本文以燕山板栗品种“燕红”为试材，对果实发育过程中的重量进行了测定，并采用双波长紫外分光光度计法对直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量进行测定分析；利用酶偶联反应对淀粉合成关键酶可溶性淀粉合成酶（SSS）的活性进行测定；克隆获得可溶性淀粉合成酶基因（SSS基因）并对动态表达情况进行分析。
本课题表明，板栗果实成熟后期总淀粉的积累主要取决于支链淀粉的快速积累，SSS基因是板栗果实发育后期淀粉迅速积累的关键基因。
关键词 ：板栗 淀粉合成 可溶性淀粉合成酶（SSS） 关键酶基因 克隆
去年暑假，我和家人去唐山遵化、迁西和迁安等地旅游，发现当地都有大面积的板栗种植。板栗营养价值很高，甘甜芳香，可供人体吸收和利用的养分高达 98％。更值得一提的是板栗果实中含有和面粉一样的淀粉，可以解决温饱问题。我由此想到我们的国家人口众多，能不能通过现代的生物技术手段，解决我国的粮食问题呢？
回到学校，我请教了生物老师，还打电话咨询了从事果树研究工作的姐夫，他们都表示很支持我的想法，可以设置一个课题研究一下。根据我的实际情况在老师和姐夫的指导下，我设计了“燕山板栗可溶性淀粉合成酶基因（SSS基因）的克隆和功能研究”这样一个课题。
2.1 试验材料
本研究试验材料为北京农学院试验站提供的“燕红”板栗（图 2—1）。根据资料显示（张继良《板栗品种对比试验研究》），燕红单株产量很高，栗实整齐均匀，深褐或红棕色，明亮有光泽，品质优良，淀粉含量达71％。从板栗开花后55 天开始每隔4 天进行一次采样，从开花后 70 天开始每隔 3 天进行一次采样。
2.2 试验方法
图 2—1
2.2.1 板栗果实重量测定
从采集的各个样品中选出十个长势均匀的板栗果仁进行称重。
2.2.2 板栗果实淀粉含量测定
淀粉含量利用绘制标准曲线，参照何照范双波长紫外分光光度计法，总淀粉含量为直链淀粉含量与支链淀粉含量之和。
2.2.3 SSS酶活性的测定
利用以下酶偶联反应测定NADPH（还原型辅酶—Ⅱ，学名烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，）在 340nm的特征吸收光谱的变化来测SSS酶的活性。它的原理是在可溶性淀粉合成酶（SSS）/颗粒紧密结合的淀粉合成酶（GBSS）作用下，腺苷二磷酸葡萄糖（ADPGlc）的葡萄糖残基通过α—1，4—糖苷键转移至葡聚糖链（（glucosyl）n）的非还原性末端。 PEP（磷酸烯醇丙酮酸，Phosphoenolpyruvic acid；缩写PEP）在相关ATP合成酶的作用下将磷酸转移给ADP，获得了直接能源物质ATP，ATP又在相关酶的作用下将葡萄糖磷酸化成α⁃glucosyl⁃6⁃P，α⁃glucosyl⁃6⁃P在相关酶的作用下又将NADP（辅酶—Ⅱ）给还原形成NADPH（还原型辅酶—Ⅱ），这一系列的反应是密切相关的，所以通过测定NADPH在 340nm的特征吸收光谱的变化来反应SSS/GBSS的活性
2.2.4 板栗果实总RNA的提取及纯化
使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司）提取各个时期板栗总RNA。操作过程参考说明书并稍作改进。
（1）试验前研钵的无RNase（核糖核酸酶，Ribonuclease，RNase）处理：向研钵中倒入少量无水乙醇，灼烧处理，以铝箔纸封口，冷却后置于－80℃冰箱保存；
（2）于 1.5ml RNase free（不含RNA水解酶）离心管中加入 500 μL裂解液（含2％β⁃巯基乙醇）和 60 μL PLANTaid（植物RNA助提剂）并混匀；
（3）将适量板栗果实于液氮中快速充分研磨，取 50mg细粉转入上述混液中，立刻剧烈旋涡震荡 2 min，以充分裂解；
（4）13 000 rpm，10 min；
（5）吸取上清于 50％的水乙醚中，震荡，12 000 rpm离心 30 s；
（6）除去上层水乙醚，吸下层液体于 0.5 倍体积的无水乙醇中，立即吹打混匀 10次左右；
（7）加入吸附柱（吸附柱放入收集管中），12 000 rpm离心 30 s，弃掉废液；
（8）加入 350 μL去蛋白液，室温放置 5 min，12 000 rpm离心 30 s，弃掉废液；
（9）消化DNA：加入 80 μL RNA⁃FREE DNAⅠ（天根生化科技（北京）有限公司），室温放置 15 min；
（10）加入 350 μL去蛋白液，室温放置 5 min，12 000 rpm离心 30 s，弃掉废液；
（11）加入 500 μL漂洗液，12 000 rpm离心 30 s，漂洗两次；
（12）弃废液后，12 000 rpm离心3 min，尽量除去漂洗液，以避免漂洗液残留乙醇抑制下游试验；
（13）取出吸附柱，放入另一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜中间部位加入 30—50 μL RNase free water（70℃预热），室温放置2 min，12 000 rpm离心 1 min；
（14）取 2 μL样品进行 1％琼脂糖凝胶电泳检测；同时，用核酸蛋白仪进行浓度测定；
（15）其余样品暂存于冰盒中用于随后的cDNA合成；或液氮速冻后于－80℃冰箱长期保存。
2.2.5 cDNA第一链的合成
使用Reverse Transcriptase M⁃MLV（RNase H⁃）（宝生物工程有限公司，TaKaRa）对总RNA进行反转录。利用的是基因重组技术克隆表达的RNase H活性缺失型MMLV反转录酶。一般的野生型M⁃MLV（Moloney Murine Leukemia Virus）具有以下几种活性：依赖于RNA的DNA聚合酶活性；依赖于DNA的DNA聚合酶活性；RNase H活性。由于RNase H能够催化降解DNA/RNA杂合体中的RNA，因此在cDNA第一条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。本酶M⁃MLV（RNase H̄）的RNase H活性缺失，延伸能力强，可用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。操作步骤如下：
（1）200 μL RNase⁃Free PCR管中配制：
Oligo（dT）18 （10 μM） 1 μL
总RNA 1 μg
RNase free dH2O 4 μL
总体积 6 μL
（2）70 ℃ 10 min；冰上骤冷 3 min并短暂离心；
（3）冰上配制：
（4）42 ℃保温 1 h；
（5）70 ℃保温 15 min，之后冰上冷却；
（6）－20 ℃保存。
2.2.6 淀粉合成关键酶基因—SSS基因片段的克隆
根据Genbank中拟南芥、杨毛果、鹰嘴豆、小麦和玉米等的各淀粉合成关键酶基因的保守序列，设计了SSS基因的简并引物。引物序列如下：
以最后一个时期即成熟的板栗果实的cDNA为模板进行PCR扩增。
PCR扩增体系：
反应程序为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34 次循环，最后 72℃ 10 min。将PCR产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳分析，并进行切胶回收目的片段。
2.2.7 PCR产物的回收与纯化
使用DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）进行回收、纯化，步骤如下：
（1）用刀片将DNA条带从琼脂糖凝胶上切下（尽量剔除多余的凝胶），放入 1.5 mL离心管中；
（2）按 1 mg胶块：400 μL溶胶液溶胶，58 ℃水浴放置 10 min，期间上下翻转数次，确保凝胶块完全溶解；
（3）取一个离心吸附柱，套于收集管中，将上述溶液加入到吸附柱中，12 000 rpm离心 30 s，倒掉收集管中的废液；
（4）加入 500 μL漂洗液，12 000 rpm离心 30 s，倒掉收集管中的废液；
（5）将离心吸附柱放回收集管中，12 000 rpm离心 3 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温 3 min，彻底晾干；
（6）将吸附柱放到一个干净的 1.5 mL离心管中，向吸附柱中间位置处悬空滴加ddH2O（预热至 64 ℃）20—40 μL，室温放置 2 min；
（7）12 000 rpm离心 2 min，收集DNA溶液；
（8）－20 ℃保存备用。
3.1 板栗果实的形态及重量变化
燕红板栗果实在花后 50 天左右开始坐果，试验从花后 55 天开始采样。随着花后天数的增加，果实的重量也不断增加（图3—1）。究其原因可能是在板栗果实成熟后期，淀粉积累加快，果实重量随干物质的增加而增加。
图 3—1 燕红板栗果实花后形态变化
3.2 板栗果实的淀粉含量变化
用双波长紫外分光光度计法测得果实中的总淀粉、直链淀粉及支链淀粉的含量变化（图 3—2）。
图 3—2 燕红板栗花后淀粉、直链淀粉和支链淀粉的变化
在板栗果实发育过程中，其总淀粉含量由初始的 61.56mg·g －1 增加到 391.65 mg·g －1 ，直链淀粉含量由 13.90mg·g －1 增加到 95.43mg·g －1 ，支链淀粉含量由47.66 mg·g －1 增加到296.22 mg·g －1 。板栗果实直链淀粉的积累较平稳，净增加量在 3.5—18 mg·g －1 之间浮动；支链淀粉净增加量变化较大，果实成熟初期淀粉积累较快，中期趋于平稳，花后 82 天－86 天果实成熟时支链淀粉迅速积累，净增加量达到 159.714 mg·g －1 （图3—3），成熟时果实淀粉含量略有下降；研究显示板栗果实花后各时期，支链淀粉含量均高于直链淀粉的含量，成熟时总淀粉中支链淀粉占到87.8％，故板栗淀粉含量的积累取决于支链淀粉的积累，其变化趋势也与支链淀粉相似。
图 3—3 燕红板栗花后淀粉、直链淀粉和支链淀粉的净增加量
3.3 淀粉合成酶SSS活性动态变化
由图 3—4 可以看出，随着板栗果实的发育，果实中SSS活性变化为单峰曲线变化，SSS的活性在花后 55 天后持续增加，都于花后74天达到峰值，活性为 26.90mol·g －1 FW· min －1 ，然后又于花后90天成熟时下降至 4.723.39mol ·g －1 FW·min －1 。这说明板栗果实在花后 65天至74天之间是淀粉积累较迅速的时期。
图 3—4 燕红淀粉合成关键酶SSS活性的动态变化
3.4 淀粉合成酶SSS和淀粉净增加量的相关性分析
用SPSS软件对花后 70 天至 78 天淀粉合成关键酶和淀粉净增加量进行相关性分析。如表 3—1 所示，SSS的活性与板栗果实支链淀粉及总淀粉净增加量均呈显著正相关。
表 3—1 SSS活性与淀粉净增加量的相关性分析
3.5 板栗果实总RNA的提取
使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司）提取各个时期板栗总RNA，取 2 μL RNA样品进行 1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，28S、18S rRNA条带清晰可见，没有弥散，没有DNA残留，提取的质量较好，可用于后续cDNA的合成。
图 3—5 板栗果实RNA凝胶电泳图
3.6 淀粉合成酶SSS基因片段克隆
本试验首先设计简并引物PCR，先从板栗果实cDNA文库中克隆SSS基因的部分片段，得到SSS（965bp）条带（图 3—6）及其序列。通过NCBI BLAST同源性序列分析表明SSS与Solanum tuberosum（Y10416.1）、Sorghum bicolor（AF168786.2）和Arabidopsis thaliana（AK226881.1）的SSS基因的同源性分别为 77％、74％和 77％。上述结果表明已经克隆到了SSS基因片段，可以用于设计定量特异PCR引物。
图 3—6 SSS基因的扩增结果
3.7 淀粉合成酶SSS基因表达量的变化及其与淀粉积累的相关性分析
采用实时荧光定量PCR方法，对从花后 55 天至花后 90 天采集的 9 个时期燕红板栗果实SSS基因的相对表达量进行检测，结果如图 3—7 所示。
图 3—7 燕红板栗花后SSS的相对表达量
SSS基因的相对表达量花后 55 ～ 74 天的变化趋势逐渐增加，74 天时达到一个小的峰值，74 ～82 天其表达量有所降低，在花后 82 ～ 86 天其表达量迅速增加，花后86 天SSS基因的相对表达量约是花后 74 天小峰值的 30 倍，果实成熟时及花后 90天时其表达量又有所下降。
使用SPSS软件对淀粉合成关键酶基因表达量的变化与淀粉积累的相关性进行分析，由表 3—2 可知，SSS相对表达量与板栗果实支链淀粉呈极显著正相关，SSS相对表达量与总淀粉净增加量呈显著正相关。
表 3—2 SSS基因的相对表达量与淀粉净增加量的相关性分析
4.1 燕山板栗淀粉含量及其积累规律
板栗果实淀粉在积累的过程中，淀粉含量不断增加，初期增加较缓慢，中期趋于平稳，花后 82 天—86 天果实成熟时支链淀粉迅速积累，净增加量达到 125.8 mg·g － 1 ，这与水稻小麦等作物的淀粉积累规律差异较大。水稻小麦等作物的淀粉积累初期增加较快，逐渐加快，后期变慢，达到最大值时淀粉含量不再增加。
4.2 板栗淀粉积累与合成关键酶活性的关系
关于SSS酶在淀粉合成中的作用前人有较多的报道，Keeling等（1988）认为，SSS酶是控制小麦淀粉积累的关键酶；而刘霞等（2005）认为小麦籽粒中淀粉积累速率、直链淀粉和支链淀粉的积累量与SSS酶单个酶活性的高低并不存在必然联系。本研究中，花后 65 天至 78 天为板栗果实中各种淀粉合成关键酶活性较大时期，SSS酶的活性与板栗果实支链淀粉及总淀粉净增加量呈显著正相关，这与前人的研究结果相同。
4.3 板栗淀粉积累与合成关键酶基因表达量的关系
淀粉合成酶基因的表达在板栗果实成熟时达到峰值，水稻小麦等呈现单峰曲线，而板栗果实淀粉合成关键酶基因的表达呈多峰曲线并在果实成熟后期突然达到峰值，植物体内淀粉合成酶基因在淀粉合成过程中所起的作用存在较大的差异：SSS基因在支链淀粉合成过程中起着不可缺少的作用，若该基因发生突变或转入反义SSS基因，其结构发生改变，酶活性下降，支链淀粉含量也相应地降低；SSS基因相对表达量与支链淀粉净增加量均呈极显著正相关，并且推测SSS基因相对表达量与支链淀粉净增加量均呈极显著正相关是板栗果实成熟后期淀粉快速积累的原因。
从研究结果中可以做出以下总结，本实验成功的克隆出板栗果实淀粉合成的关键酶基因—SSS基因，并初步研究了淀粉积累和淀粉合成酶的相关性。结果表明，板栗果实成熟后期总淀粉的积累主要取决于支链淀粉的快速积累，SSS基因是板栗果实发育后期淀粉迅速积累的关键基因。
首先，我深深体会到科研不是一时的兴趣，它大多的时候是枯燥无味的重复，但成功的结果会让你觉得付出是值得的。但有时会努力付诸东流，所以一个优秀的科研工作者应该能够沉下心来，耐得住寂寞。其次，通过在实验室对基因的克隆实验，让我对深奥神秘的生命世界有了更深的了解，极大地激发了我对科学研究的浓厚兴趣。再次，通过分析实验结果，让我学会文献查找的方法、激发了求知欲望，操作生理生化实验培养了我的动手能力、培养了我对科学严谨的态度。
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