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1909年10月26日，安重根被监禁于日本总领事馆。10月30日，日本关东督府地方法院检察官沟渊孝雄、书记官岸田爱文，还有从朝鲜汉城（今韩国首尔）“统监府”来的翻译园木未喜来到领事馆，对安重根进行了第一次正式审讯。在一开始问及为什么仇恨伊藤时，安重根立即列出了伊藤“杀朝鲜明成皇后”、“废黜朝鲜皇帝”、“解散朝鲜军队”等15条罪状，为了不累及同党和家属，安重根说整个行动都是他自己所为。
1909年11月1日，安重根结束了在哈尔滨11天的生活，与禹德淳、曹道先、刘东夏等八人前往旅顺监狱，日俄各自派十几名宪兵押送。11月3日，安重根等人到达，被收押于旅顺日俄监狱。
从1909年11月14日起至1910年1月26日，对安重根进行了11次审讯，1910 年2月7日至2月14日又进行了有禹德淳、曹道先和刘东夏参加的六次公判。
对安重根的审讯，一开始是正常的，检察官的态度也很好，并允许一位英国律师和一位俄国律师为安重根辩护。但后几次态度完全变了，到了公判时，英、俄、朝律师虽然出席，可不许他们辩护，只能旁听。安重根要陈述自己的观点，被审判官岔开。
2月9日第三次公判，进行到一半时，安重根借法官给他的陈述机会，发表了观点：“刺杀伊藤并非我个人行为，而是为了东洋和平。日本天皇宣称进驻是为维持东洋和平，巩固朝鲜独立。但伊藤来当统监，违背皇旨，欺上瞒下，缔结不平等条约，废黜韩帝……此次义举是朝鲜独立的一部分，我是以义兵参谋中将的身份与敌国战斗，并非普通刺客，应是被敌军捕获的俘虏……听说伊藤是功臣，可他也是逆贼，更是东洋和平的破坏者！”
安重根还要讲下去，法官却大惊失色，宣布休庭。再审时已不许他人旁听，法官对安重根说：“不许你说刚才的话。”安重根表示：他要表明观点，可法官却不让讲，还禁止旁听，也就没有说的必要了。但仍阐述了东洋要和平、日朝要友好、朝鲜要独立的观点。
1910年2月14日，日本关东督府地方法院判决安重根死刑，判禹德淳三年徒刑，曹道先、刘东夏各一年六个月徒刑。虽然给了五日的上诉权，但安重根只说了对死刑判决不服的理由，并没上诉，他说：“我是战俘，应按国际公法处理……我是为东洋和平杀死伊藤的，我不怕死，所以不上诉。假如我有罪，就罪在我是个善良而弱小的朝鲜国民！”
安重根请求将他的刑期推迟一个月，以便写一部《东洋和平论》，法院院长答应了，可后来又食言了。这时，法院与监狱的许多官吏买来绢、纸几百张，求安重根题词留做纪念，安重根每天都书写数小时。他还要写《东洋和平论》，可是因刑期提前而没有写完。安重根又用其教名“多码献”给母亲、妻子和洪神父分别写了遗书。
1910年3月10日，安重根的两个弟弟安定根、安恭根及洪神父来到旅顺日俄监狱探望，安重根给他们留下了《告同胞言》和《最后的遗言》。《告同胞言》中说“我两千万兄弟姐妹各自奋发……若能继承我的遗志，恢复自由独立，我死而无憾也。”《最后的遗言》中说：“我死之后，希望把我的遗骨埋在哈尔滨公园旁，等我们恢复主权后返葬到故国。……当大韩独立的消息传到天国时，我一定会欢呼，高唱万岁。”
1910年3月26日，安重根穿上母亲为他做的朝鲜民族服装。上午10时，安重根走上绞架，从容就义。他的两个弟弟要求引渡遗体，日本人却强行将二人送回朝鲜。安重根的遗体被秘密埋在旅顺某地。