第七节
物质的分离技术

物质的分离是把混合物中各物质经过物理（或化学）变化，将其彼此分开的过程，分开后各物质要恢复到原来的状态；物质的提纯是把混合物中的杂质除去，以得到纯物质的过程。在提纯中如果杂质发生化学变化，不必恢复为原来的物质。在进行物质分离与提纯时，应视物质及其所含杂质的性质选择适宜的方法。

一、物质的分离与提纯常用的物理方法

1.过滤

过滤是一种固液分离最常用的操作方法。常用的过滤方法有常压过滤、减压过滤和热过滤三种。

（1）常压过滤

常压过滤是在常压下用普通漏斗过滤，它是最常用、最简便的方法，因此又称为普通过滤，该方法适用于过滤胶状沉淀或细小的晶体沉淀，但其缺点是过滤速度较慢。所用的仪器主要是过滤器（漏斗和滤纸组成）和漏斗架（也可用铁架台和铁圈代替）。过滤之前，按沉淀物的多少选择合适的漏斗并根据漏斗的大小选择合适的滤纸。滤纸分为定性滤纸和定量滤纸两种，按滤纸空隙的大小可分为“快速”“中速”“慢速”三种。

操作应注意做到“一角、二低、三接触”：

①“一角”滤纸折叠的角度要与漏斗的角度（一般为60°）相符。折叠后的滤纸放入漏斗后，用食指按住，加入少量蒸馏水润湿，使之紧贴在漏斗内壁，赶走纸和壁之间的气泡。

②“二低”滤纸边缘应略低于漏斗边缘；加入漏斗中液体的液面应略低于滤纸的边缘（低约1 cm），以防止未过滤的液体外溢。

③“三接触”漏斗颈末端与承接滤液的烧杯内壁相接触，使滤液沿烧杯内壁流下；向漏斗中倾倒液体时，要使玻璃棒一端与滤纸三折部分轻轻接触；承接液体的烧杯嘴和玻璃棒接触，使欲过滤的液体在玻璃棒的引流下流向漏斗。过滤后如果溶液仍然浑浊，应重新过滤一遍。如果滤液对滤纸有腐蚀作用，一般可用石棉或玻璃丝代替滤纸。如果过滤是为了得到洁净的沉淀物，则需对沉淀物进行洗涤，方法是：向过滤器里加入适量蒸馏水，使水面浸没沉淀物，待水滤去后，再加水洗涤，连续洗几次，直至沉淀物洗净为止。

（2）减压过滤

减压过滤（也称抽滤或真空过滤）能加速过滤速度，而且沉淀抽吸得比较干燥（图2-23）。但该方法不适合过滤颗粒太小的沉淀和胶体沉淀。因为颗粒太小的沉淀易在滤纸上形成一层致密的沉淀而堵塞滤孔，使滤液不易透过并减慢抽滤速度；胶体沉淀在快速过滤时易穿透滤纸，因而均达不到过滤的目的。

减压过滤是利用真空泵产生的负压带走瓶内的空气，使抽滤瓶内的压力减小。由于布氏漏斗的液面上与抽滤瓶内形成压力差，从而加快过滤速度。

实验室使用的抽滤泵一般为循环水式多用真空泵。在进行减压过滤时，先将减压过滤装置中的安全瓶出口与真空泵抽气管接口之间用橡皮管连接，接通电源后，指示灯亮，电动机转动并带动循环水使抽滤瓶内压力逐渐降低，以达到减压过滤的目的。抽滤完毕，通常先拔开吸滤瓶与安全瓶相连的橡皮管，也可以拔开布氏漏斗塞子，然后再关电源开关，否则循环水将倒灌。有安全瓶就可以防止吸滤瓶内滤液受到污染。减压过滤的操作步骤如下：

①滤纸的准备将布氏漏斗倒立在滤纸上并用力压使之出现一痕迹，用剪刀沿痕迹内缘剪下，使滤纸能全部覆盖布氏漏斗底部。

②铺滤纸布氏漏斗的圆柱形底部是带有许多小孔的瓷板，以便使滤液穿过滤纸从小孔流出，抽滤时此瓷板支撑着滤纸和截留在滤纸上的固体。将剪好的滤纸平放于布氏漏斗中并加少量蒸馏水湿润，再将吸滤装置连接好。漏斗插入抽滤瓶中（注意橡皮塞插入抽滤瓶内的部分不超过整个塞子高度的1／2），其下端的斜面应对着抽滤瓶侧面的支管。打开真空泵电源，滤纸即紧贴于漏斗底部。

③过滤摇动盛沉淀物的容器使沉淀物与溶液混匀，先将容器里的少许溶液沿玻璃棒转入漏斗中，每次转入的量不能超过漏斗容量的2／3，然后打开真空泵，再将剩余的沉淀转入布氏漏斗中，直至沉淀被抽吸得比较干净为止。注意抽滤瓶中的液体不能超过吸气口。

④沉淀洗涤洗涤沉淀时，应先拔掉橡皮管并关好真空泵，加入洗涤液至全部湿润沉淀。然后接好橡皮塞，开启真空泵，将沉淀中的水分吸干，最后拔掉橡皮管并关闭真空泵。

⑤取出沉淀和滤液将漏斗取下倒放于滤纸上或容器中，在漏斗的边缘轻轻敲打或用洗耳球从漏斗出口处往里吹气，滤纸和沉淀即可脱离漏斗。滤液应从抽滤瓶的上口倒入洁净的容器中，绝对不能从侧面的支管倒出，以免滤液被污染。

若过滤的溶液有强酸性或强氧化性，为了避免溶液与滤纸作用，应采用玻璃砂漏斗。由于碱易与玻璃作用，因此玻璃砂漏斗不宜过滤强碱性溶液。过滤时不能引入杂质，也不能用瓶盖挤压沉淀，其余操作步骤同上。

（3）热过滤

如果溶液的溶质在温度降低时易结晶析出，而又不希望它在过滤过程中留在滤纸上，这就需要采取热过滤。常压热过滤漏斗是由铜质夹套和普通玻璃漏斗组成的（如图2-24）。

热过滤漏斗是一种减少散热的夹套式漏斗，其是在金属铜套内放置一短颈且粗的玻璃漏斗而形成的。使用时在夹套内加入热水，加热侧管。在玻璃漏斗中放入折叠滤纸，用少量热水湿润试纸，立即将热溶液分批转入漏斗中，但溶液不能太满，也不要等滤完再转入溶液，未转入的溶液和保温漏斗应小火加热，保持微沸。

若操作顺利，只会有少量结晶在滤纸上析出，可用少量热溶剂洗下，也可弃之，以免得不偿失。若结晶较多，可将滤纸取出，用刮刀刮回原来的容器中并进行热过滤。过滤完毕，将溶液加盖放置使其自然冷却。进行热过滤操作时，要求准备充分，动作迅速。

热过滤的特点及注意事项：

①采用保温热过滤漏斗套，漏斗套的夹层中装有热水，必要时还可用灯具加热，使用时注意夹套内水不要加得太满，以免水沸腾后溢出；也不可太少，必须确保加热支管中充满水，否则在加热支管无水的情况下加热，会使保温漏斗损坏。

②采用短颈漏斗，避免滤液在漏斗颈中冷却析出晶体造成阻塞。使用时将短颈漏斗按普通过滤要求将滤纸装好，然后放在铁圈上（若漏斗小时可放泥三角），如过滤时间较短，也可以事先将玻璃漏斗在水浴上用蒸气加热或放入沸水中加热后立即使用。

2.离心分离

当被分离的沉淀的量很少时，可用离心分离法。本法分离速度快，利于迅速判断沉淀是否完全。

（1）离心操作

电动离心机转动速度很快，要特别注意安全。使用离心机时，为了使离心机旋转平衡，几支离心管要放在对称的位置上，如果只有一份试样，则应在对称的位置放另一支离心管，管内装等量的水。各离心管的规格应相同，加入离心管内液体的量不得超过其体积的一半，各管溶液的高度应相同。放好离心管后，把盖旋紧。开始时应把变速旋钮旋到最低挡，以后逐渐加速；离心约1 min后，将旋钮逆时针旋到停止位置，任离心机自行停止，绝不可用外力强制它停止运动。

电动离心机如有声音或机身振动时，应立即切断电源，查明和排除故障。

（2）分离溶液和沉淀

离心沉降后，可用吸出法分离溶液和沉淀。先用手挤压滴管上的橡皮帽，排除滴管中的空气，然后轻轻伸入离心管清液中，慢慢减小对橡皮帽的挤压力，清液就被吸入滴管。随着离心管中溶液液面的下降，滴管应逐渐下移。滴管末端接近沉淀时，操作要特别小心，勿使它接触沉淀。最后取出滴管，将清液放入接收容器内。

（3）沉淀的洗涤

如果要得到纯净的沉淀，必须经过洗涤。往盛沉淀的离心管中加入适量的蒸馏水或其他洗涤液，用细搅棒充分搅拌后，进行离心沉降，用滴管吸出洗涤液，如此重复操作，直至洗净。

3.蒸馏

蒸馏是提纯液体物质和分离混合物的一种常用的方法，可分为常压蒸馏和减压蒸馏。

（1）常压蒸馏

如图2-27所示，常压操作应注意的事项：

①蒸馏烧瓶中所盛液体不能超过其容积的2／3，也不能少于1／3。

②温度计水银球部分应置于蒸馏烧瓶支管口下方约0.5 cm处。

③冷凝管中冷却水从下口进，上口出。

④为防止暴沸可在蒸馏烧瓶中加入适量碎瓷片或沸石。

⑤蒸馏烧瓶的支管和伸入接液管的冷凝管必须穿过橡皮塞，以防止馏出液混入杂质。

⑥加热温度不能超过混合物中沸点最高物质的沸点。

（2）减压蒸馏

在蒸馏操作中，一些有机物加热到其正常沸点附近时，会由于温度过高而发生氧化、分解或聚合等反应，使其无法在常压下蒸馏。若将蒸馏装置连接在一套减压系统上，在蒸馏开始前先使整个系统压力降低到只有常压的十几分之一至几十分之一，那么这类有机物就可以在较其正常沸点低得多的温度下进行蒸馏。

①减压蒸馏装置减压蒸馏装置由两个系统构成，一个是蒸馏系统，包括蒸馏烧瓶、Y型管、蒸馏头、直型冷凝管、真空接液管、接收瓶、温度计及套管、毛细管等；另一个是真空系统，包括抽气泵、真空表和安全瓶。两个系统间用耐压胶管（真空胶管）连接（图2-28）。有时接收烧瓶需用冷却装置强制冷却。

②安装蒸馏装置从左向右依次安装蒸馏烧瓶、Y型管、蒸馏头、直型冷凝管、真空接液管、接收瓶，真空接液管的支管连接一个安全瓶，安全瓶的支管连接在抽气泵上。启动抽气泵，旋紧安全瓶上旋塞和毛细管上螺旋夹，检查整个装置的气密性。待达到所需的真空度后，放开安全瓶上旋塞，恢复系统的常压状态。

气化中心设置：减压蒸馏时不能用碎瓷片、一端封口的断毛细管等形成气化中心，可以用一根上端粗、下端细的两端开口毛细管从蒸馏头直管上伸入蒸馏烧瓶液面下，上端用胶管连接并用螺旋夹控制。也可以用磁力搅拌器带动搅拌子形成气化中心。

③减压蒸馏操作在蒸馏烧瓶中加入待蒸馏液体，不能超过烧瓶容积的1／2。开启抽气泵，旋紧安全瓶旋塞，待达到所需真空度后开始加热。观察毛细管下端逸出的气泡，使其不中断。控制加热强度，勿使蒸馏过剧。观测出现第一滴馏出液时的温度，待达到所需蒸馏温度时再开始接收馏出液，此前收集的馏出液为前馏分，单独处理。蒸馏结束时，先停止加热，再放开安全瓶上的旋塞，收集馏出液，从右向左拆卸各组件。

（3）旋转蒸发仪

旋转蒸发仪主要用于在减压条件下连续蒸馏大量易挥发性溶剂。旋转蒸发仪主要部件包括：

①旋转马达，带动样品旋转，增大蒸发表面积。

②密封圈，保持旋转蒸发仪系统良好的气密性。

③真空泵和真空控制器系统，用来降低蒸馏溶剂的沸点，并控制最佳真空，实现高效蒸馏。

④水油通用加热锅，加热样品，提高蒸馏速率。

⑤冷凝管，使用三层冷凝设计或者其他冷凝剂（如干冰_丙酮）冷凝样品。

⑥冷凝样品收集瓶，实现蒸馏溶剂的回收，一般需要低温。

⑦机械或马达机械装置，用于将加热锅中的蒸发瓶快速提升。

旋转蒸发仪的使用要点如下：

①用弹簧夹固定烧瓶与蒸发仪的连接部位。

②待装置稍变为减压状态时，就同时开始旋转蒸发器。

③慢慢地小心谨慎地进行排气操作。要预先考虑到，如果有发泡或暴沸等情况，应能马上中止排气。

④如果装置已减压到相当程度，并且也没有发泡和暴沸等现象了，即开始加热。要保持热水浴的温度在溶剂的沸点以下，以免发生沸腾。

⑤要把装置内恢复到常压时，必须停止旋转蒸发器，并注意防止烧瓶脱落。

4.蒸馏与蒸发

将蒸馏原理用于多种混溶液体的分离，叫分馏，分馏是蒸馏的一种。蒸馏与蒸发的区别：加热是为了获得溶液的残留物（浓缩后的浓溶液或蒸干后的固体物质）时，要用蒸发；加热是为了收集蒸气的冷凝液体时，要用蒸馏。

蒸发操作应注意的事项：蒸发皿中的溶液不超过蒸发皿容积的2／3；加热过程中要不断搅拌，以免溶液溅出；当析出大量晶体时就应熄灭酒精灯，利用余热蒸发至干。

5.通常采用的结晶方法

（1）蒸发结晶

蒸发溶剂，使溶液由不饱和变为饱和，继续蒸发，过剩的溶质就会呈晶体析出，叫蒸发结晶。例如，当NaCl和KNO ₃ 的混合物中NaCl多而KNO ₃ 少时，即可采用此法，先分离出NaCl，再分离出KNO ₃ 。

（2）降温结晶

先加热溶液，蒸发溶剂成饱和溶液，此时降低热饱和溶液的温度，溶解度随温度变化较大的溶质就会呈晶体析出，叫降温结晶。例如，当NaCl和KNO ₃ 的混合物中KNO ₃ 多而NaCl少时，即可采用此法，先分离出KNO ₃ ，再分离出NaCl。

6.萃取

如图2-30所示，萃取的操作方法如下：

（1）用普通漏斗把待萃取的溶液注入分液漏斗，再注入足量萃取液。

（2）随即振荡，使溶质充分转移到萃取剂中。振荡的方法是用右手压住上口玻璃塞，左手握住活塞部分，反复倒转漏斗并用力振荡。

（3）将分液漏斗置于铁架台的铁环上静置，待分层后进行分液。

分液的操作方法如下：

①用普通漏斗把要分离的液体注入分液漏斗内，盖好玻璃塞。

②将分液漏斗置于铁架台的铁圈上，静置，分层。

③将玻璃塞打开，使塞上的凹槽对准漏斗口上的小孔再盖好，使漏斗内外空气相通，以保证漏斗里的液体能够流出。

④打开活塞，使下层液体慢慢流出，放入烧杯，待下层液体流完立即关闭活塞，注意不可使上层液体流出。

⑤从漏斗上端口倒出上层液体。

（4）蒸发萃取剂即可得到纯净的溶质。

为把溶质分离干净，一般需多次萃取。

7.渗析

将欲提纯或精制的胶体溶液放入半透膜袋中，用细绳把袋口扎好，系在玻璃棒上，然后悬挂在盛蒸馏水的烧杯中（半透膜袋要浸入水中），胶体溶液中的分子或离子就会透过半透膜进入蒸馏水中。悬挂的时间要充分，蒸馏水要换几次，直至蒸馏水中检查不出透过来的分子或离子为止，如图2-31所示。例如，把淀粉胶体里的食盐分离出去，即采用渗析方法。

8.层析

在分离分析，特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。

（1）吸附层析

①吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成的一种层析方法。

②薄层层析薄层层析是以涂布于玻璃板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。

③聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离物在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。

（2）离子交换层析

离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。

（3）凝胶过滤

凝胶过滤又叫分子筛层析，其原理是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开。

9.电泳

电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。

电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离分析，但目前一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。

电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12～14 cm，厚度为1～2 mm。近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。水平式电泳，凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液，或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。

电泳分析常用方法介绍如下：

（1）纸电泳

纸电泳是用滤纸作支持物的一种电泳技术。1984年Wiselius等首次将纸电泳用于氨基酸和多肽物质的分离。电泳装置包括电泳槽和电泳仪两部分。最常用的电泳槽是水平电泳槽，包括电极、缓冲液、液槽、电泳介质冷凝槽、透明罩等。电泳仪可提供电源电势，它与电泳槽的两个电极柱相连，在电泳槽两端加上了一个稳定的电场。纸电泳分低压电泳和高压电泳两种，低压电泳电压一般为100～600 V，高压电泳电压一般为500～1 000 V。

实验时，将电泳槽洗净、晾干、放平，然后在两个电泳槽中倒入缓冲液，使两液面平衡，将滤纸条一端浸入缓冲液，另一端搭在电泳槽支架上。将滤纸剪成适当尺寸（通常2～3 cm）搭在滤纸条上，接通电泳仪电源，调节到一定的电压，即可进行电泳。电泳时间根据样品的性质而定。在做高压电泳时，为防止温度升高引起的样品变性，在电泳过程中要通冷凝水。电泳完毕，切断电流，在滤纸与溶液界面处划上记号，以便计算滤纸的有效长度。然后将滤纸平铺在玻璃板上，置于70℃左右的烘箱烘干。烘干后的滤纸按不同的方法进行显色测定。

（2）醋酸纤维素薄膜电泳

醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5μg的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。

醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其他透明液处理后，可使膜透明化，有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存。

①材料与试剂醋酸纤维素膜一般使用市售商品，常用的电泳缓冲液为pH＝8.6的巴比妥缓冲液，浓度在0.05～0.09 mol／L。

②操作要点

a.膜的预处理：必须在电泳前将膜片浸泡于缓冲液中，浸透后，取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液，不可吸得过干。

b.加样：样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。对血清蛋白质的常规电泳分析，每厘米加样不超过1μL，相当于60～80μg的蛋白质。

c.电泳：可在室温下进行。电压为25 V／cm，电流为0.4～0.6 mA／cm宽。

d.染色：一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红，糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸Schiff试剂，脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。

e.脱色与透明：水溶性染料最普遍应用的脱色剂是5％醋酸水溶液。为了长期保存或进行光吸收扫描测定，可浸入冰醋酸∶无水乙醇＝30∶70（体积比）的透明液中。

（3）凝胶电泳

以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分离同种酶及其亚型、大分子核酸等，应用较广，介绍如下：

琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖，其结构单元是D_半乳糖和3，6_脱水_L_半乳糖。许多琼脂糖链因氢键及其他力的作用而互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化，常用于LDH、CK等同工酶的检测。

琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术：在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA（球形）不能进入凝胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于0。

①设备与试剂琼脂糖凝胶电泳分为垂直型和水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，应用广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有TBE（0.08 mol／L Tris·HCl，pH＝8.5，0.08 mol／L硼酸，0.0024 mol／LEDTA）和THE（0.04 mol／L Tris·HCl，pH＝7.8，0.2 mol／L醋酸钠，0.001 8 mol／L EDTA）。

②凝胶制备用上述缓冲液配制0.5％～0.8％的琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至55℃时加入溴化乙碇（EB）至终浓度为0.5μg／mL，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5～1.0 mm，待胶凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1 mm处。

③样品制备与加样溶解于TBE或THE内的样品应含指示染料（0.025％溴酚蓝或橘黄橙）、蔗糖（10％～15％）或甘油（5％～10％），也可使用2.5％FicoⅡ增加比重，使样品集中，每齿孔可加样5～10μg。

④电泳一般电压为5～15 V／cm，对大分子的分离可用电压5 V／cm。电泳过程最好在低温条件下进行。

⑤样品回收电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况，对需要的DNA分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收。如电泳洗脱法：在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶，将其装入透析袋（内含适量新鲜电泳缓冲液），扎紧透析袋后，平放在水平型电泳槽两电极之间的浅层缓冲液中，100 V电泳2～3 h，然后正负电极交换，反向电泳2 min，使透析袋上的DNA释放出来。吸出含DNA的溶液，进行酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回收。此外，还有低熔点琼脂糖法、醋酸铵溶液浸出法、冷冻挤压法等，但各种方法都仅仅有利于小分子量DNA片段（＜1 kb）的回收，随着DNA分子量的增大，回收量显著下降。

二、化学方法提纯和分离物质的“四原则”和“三必须”

1.“四原则”

一不增（提纯过程中不增加新的杂质）；二不减（不减少欲被提纯的物质）；三易分离（被提纯物与杂质容易分离）；四易复原（被提纯物质要能复原）。

2.“三必须”

一是除杂试剂必须过量；二是过量试剂必须除尽（因为过量试剂会带入新的杂质）；三是除杂途径选最佳。

三、无机物提纯一般采用的化学方法

1.生成沉淀法

例如，NaCl溶液中混有MgCl ₂ 、CaCl ₂ 杂质，可先加入过量的NaOH，使Mg ^2＋ 转化为Mg（OH） ₂ 沉淀而除去（同时引入了OH－杂质）；然后加入过量的Na ₂ CO ₃ ，使Ca ^2＋ 转化为CaCO ₃ 沉淀而除去（同时引入了CO ₃ ² －杂质）；最后加足量的盐酸，并加热除去OH－及CO ₃ ^2－ （加热的目的是赶走溶液中存在的CO ₂ 及HCl），并调节溶液的pH至中性即可。

2.生成气体法

例如，Na ₂ SO ₄ 溶液中混有少量 ，为了增加 而不引入新的杂质，可加适量稀H ₂ SO ₄ ，将 转化为沉淀和气体而除去（S ₂ O ₃ ^2－ ＋ O＋S↓＋SO ₂ ↑）。

3.氧化还原法

例如，FeCl ₂ 溶液里含有少量FeCl ₃ 杂质，可加过量铁粉将Fe ^3＋ 除去（Fe＋ 3Fe ^2＋ ）。又如，在FeCl ₃ 溶液中含有少量FeCl ₂ 杂质，可通入适量Cl ₂ 将FeCl ₂ 氧化为FeCl ₃ （2Fe ^2＋ ＋2Cl－）。

4.利用物质的两性除去杂质

例如，镁粉中混有少量铝粉，可向其中加入足量的NaOH溶液，使其中的Al转化为可溶性的NaAlO ₂ （2Al＋2OH－＋2H ₂ O ＋3H ₂ ↑），然后过滤，即可得到纯净的Mg。

5.正盐与酸式盐的相互转化

例如，Na ₂ CO ₃ 溶液中含有少量NaHCO ₃ 杂质，可用加热法使NaHCO ₃ 分解成Na ₂ CO ₃ 而除去（2NaHCO ₃ Na ₂ CO ₃ ＋H ₂ O＋CO ₂ ↑）；若NaHCO ₃ 溶液中混有少量Na ₂ CO ₃ ，可通入足量的CO ₂ 使Na ₂ CO ₃ 转化为NaHCO ₃ （CO ₃ ^2－ ＋H ₂ O＋CO ₂ HCO ₃ －）。

四、有机物的分离与提纯

有机物的分离是利用混合物各成分的密度不同、熔沸点不同、对溶剂的溶解性不同等，通过过滤、洗气、萃取、分液、蒸馏（分馏）、盐析、渗析等方法将各成分一一分离。

有机物的提纯是利用被提纯物质性质（包括物理性质和化学性质）的不同，采用物理方法和化学方法除去物质中的杂质，从而得到纯净的物质。在有机物的提纯中也必须遵循“四原则”和“三必须”。现将不同有机混合物除杂与提纯的方法及实例列表比较如下（见表2-3）。