2.9 正交度

在GC×GC中，一个样品经历了两个在线结合的不同分离过程，两个分离过程中所使用的分离机理差别越大，系统正交度越高，分离能力就越强。

假定一个样品中含有大量的分析物，其形状、颜色和大小各不相同（如图2-4）。根据Giddings理论，这一样品可以从3个维度进行表征。在这些条件下，传统1D系统无法分离所有分析物。使用1D系统时，如果根据分析物的大小进行分离，那么颜色和形状相同的分析物得不到分离；或者根据颜色进行分离，那么大小和形状相同的分析物就会共馏出；或者根据形状进行分离，大小和颜色相同的分析物得不到分离。因此，为了提高这一样品中所有组分的分离度，可以使用一个正交的2D分离系统，其维度与样品维度相匹配。在这种情况下，才可以高效利用大部分可用的分离空间，以容纳分离后的分析物，并创造一个高度成形的馏出图。

在1DGC中，很难正确定义和定量测量某些参数，如固定相极性和选择性等。GC×GC中的正交度也存在相似的问题，正交度的定义和量化存在诸多争议。

“正交”（orthogonal）这个名词在2D色谱中使用时，最容易出现矛盾。数学和统计学对正交已有系统的定义。在数学中，正交表示两个向量或函数垂直或内积为0，或一组矢量或函数，任意两个内积为0。在统计学中，正交表示一组变量统计学独立，或实验设计中探索的变量均可视为统计独立。

在分离科学中，正交这个词用于表明不同的分离或机理，而不是“独立的”或“垂直的”，通常指两个采用不同分析机理的仪器维度。对于分离维度，则两个维度的馏出时间可视为统计学独立，即两个维度使用完全独立的保留机理。

正交分离机理或正交分离是否可以获得好的分离效果取决于样品本身，包括其组分以及分离所利用的物理化学性质。例如在GC×GC中， ¹ D根据沸点分离， ² D仅有立体选择性分离机理，则只有样品中的立体异构体会表现出正交2D分离。

Schoenmakers等在不同领域对正交度进行了定义。对于分析化学，正交度在2D系统中意味着2D响应在统计学上是独立的。在GC×GC中，可以假设当两根色谱柱与样品组分以相似的方式（高相关性，低正交度）而不是互补系统（低相关性，高正交度）相互作用时，系统的实际分离能力会降低。

在GC-MS中，GC和MS是完全不同的分离机理。但是，即使在GC-MS中，对于某些样品两种技术的结果也可以相互关联，如相似的异构体混合物的保留时间和质谱结果可能均相同。正交度取决于测定的样品，但是，对于其他色谱参数，一般定义为可以用作实际目的的近似值。

在GC×GC中，具有不同固定相的两根色谱柱的保留数据在统计学意义上并不是真正正交的，因为组分的挥发性对两根色谱柱的保留都有影响。在等温模式下运行的GC×GC中，大多数组分将分布在可变宽度的对角带中，而无法使用大部分的2D分离空间。但是，当两根色谱柱使用一个通用的升温程序，即它们在同一个柱温箱中时，第二根色谱柱中的保留时间似乎独立于第一根色谱柱中的保留时间，两者之间的相关性很低，系统几乎是正交的。当第一根色谱柱为非极性固定相时，第二根色谱柱固定相为极性，即最常见的GC×GC色谱柱系统，第二根色谱柱中的非极性选择性被抵消了。

Harris和Habgood提出，对于GC程序升温模式，在从色谱柱馏出时，每种溶质在很大程度上都处于气相状态。因此，在馏出温度下， ¹ D色谱柱中产生保留的相互作用强度非常低。如果第二根色谱柱固定相为混合的相互作用，则在此温度下与第一根色谱柱固定相共同的相互作用也就不那么重要了。Seeley等在关于GC×GC保留时间预测的工作中，研究了在第二根色谱柱中的保留与 ¹ D和 ² D色谱柱中固定相-化合物相互作用之间的理论关系。在实验中，尽管 ¹ D保留时间与第一根色谱柱固定相中的线性保留指数 ¹ LRI有关，但 ² D保留时间可以近似地看作两个固定相保留指数差值（ ² RI- ¹ RI）的函数。

使用正交色谱柱系统，2D保留平面中的大部分分离区域（分离空间）可用于峰分布。但是，尽管正交度保证了保留平面的最佳通用性，但它不能保证特定样本能得到正确的分离度。如前所述，与其他分析技术一样，GC×GC中的正交度取决于样品成分和分离条件。

在开发分析方法时，正交度的概念可作为选择最佳色谱柱系统和最佳色谱条件的第一步，同时应考虑色谱柱中固定相的“整体”属性，以寻找独立的固定相-化合物相互作用，可以假设通过两个因素来解释，一个是化合物的特定值，另一个是固定相和条件。极性是与这些因素相关的一个直观概念。尽管目前已有不同的极性标度，但也存在一定问题，如固定相与不同分析物之间特定的相互作用。虽然可以通过保留少量化合物，如5到10个，来描述这种选择性行为，但是很难选择仅有“单一”相互作用的化合物。因此，应首选溶剂化参数模型。Poole等使用该模型表征了用50种不同固定相制备的毛细管柱，其数据库中包含五个温度下的色谱柱参数值，可用于固定相的分类，并作为GC×GC方法开发中色谱柱选择的参考。

但是，为了比较不同的GC×GC色谱柱系统和分离条件，无论是进行方法开发还是方法优化，都需要定量地测量正交度。

GC×GC中，分布在2D平面的每个峰的 ¹ t _R 和 ² t _R 分别对应于两根色谱柱的分离，不同的实验条件会改变峰容量和2D空间中峰的分布。正交度是分离性能（分辨能力）的定量评估，是一个定义为理想最大峰容量（ n _max ）的有效使用程度有效性因子。通常将其定义为 0 到 1，分别对应于完全相关的分离（PCS）和正交分离（OS）。正交度最大化对应于分离空间的最佳利用和样品组分的最高总体解析，有助于选择最佳的色谱柱组合和其他条件来分离复杂混合物。

有关正交度报道最多的评估办法是基于方格建立的（图2-5）。

首先，将 ¹ t _R 和 ² t _R 进行归一化。在确定 ¹ D和 ² D的峰容量后，将GC×GC 2D分离空间沿两个分离维度划分为相等的间隔，即 ¹ n _c 和 ² n _c 。接下来，根据正交度定义评估2D虚拟网格空间（矩形框）中峰的占比和分布。Gilar等提出了一个公式（公式（2）），通过方格占据的百分比来计算正交度。

公式（2）中，分子和分母分别对应于GC×GC分离的实际和理论峰容量。由于正交度是 n _c 的函数，而公式（2）只是正无穷限值 n _c 的一个特殊情况，因此Watson等对公式（2）的定义进行了修改得出了公式（3）。

Liu和Paterson通过类似的集合统计和几何方法来测量正交度。当 ¹ D和 ² D的两组保留数据被视为向量时，可以从它们的相关系数 C _i，j 定义数学正交度。该系数的值介于0（完全正交的分离）和1（正交度最小）。 C _i，j 为正交度的定量度量。从 C _i，j 值可以计算图2-6中角度 β 的值。在图2-3中，β可通过正交度测定估算而得。实际可用于分离的峰容量为用“A”表示的区域，总峰容量 ^t n = ¹ n × ² n ，GC×GC峰不会出现在图2-4中标注“N”的区域，只有标注“A”的区域可以用于分离。从 C _i，j 值（作为正交度的测量表征）可以测定可用分离空间的相对值，作为“实际”峰值容量的度量。但是，这些方法都没有考虑2D平面中峰分布的相关性。

信息论原理的方法认为色谱分离和熵的基本概念之间具有数学一致性。几何方法使用因子分析研究GC×GC分离能力，以及在平行四边形或其他图形中的峰分布。基于方格占比原理的信息理论方法通过使用2D峰分布的条件熵对正交度进行了评估。但是，这些方法不能对GC×GC 2D分离空间中非对角线分布的分析物进行准确的正交度计算，且存在一定局限性，例如：

（1）每个正交度度量的值并不仅仅对应于GC×GC分离的某一种情况，即该指数不够灵敏，无法确定GC×GC分离中的细微差别；

（2）仅能使用导出的数据来定义正交度，无法使用包含保留信息的原始数据；

（3）仅考虑方块的占用比率，而不考虑方块在2D平面中的相关性；

（4）正交度的数值通过人工限制为0~1，而对于真正的分离，这是无法实现的，而且可能不适用于某些分离情况。

Slonecker等将信息理论用于正交度的测量。使用信息相似度（IS）表征在分离空间某些区域中分析物拥挤的程度。低IS值对应于低水平的溶质拥挤，而接近1的IS值表示高度的峰重叠，与正交度相反。此研究用信息熵描述了分离空间中的峰散射（样品中组分不确定度的降低）。所使用的参数（熵）是两个色谱柱系统中每个色谱柱贡献的信息熵的相对百分比。0和100%的百分比熵（PS）值分别对应于完全正交和非正交的系统。IS和PS值可以通过实验中GC×GC色谱柱保留时间计算得到，但如果在远离分离空间对角线的区域频繁出现峰或峰簇，并且未考虑程序升温操作，该方法会出现一些偏差。

作为正交度评价时，分离空间的覆盖范围取决于样品组分的特性。Ryan等使用具有较宽极性范围的测试混合物，五个极性依次增强的 ¹ D色谱柱和两个 ² D色谱柱（极性和非极性）。不同色谱柱系统的分离空间覆盖率既通过实验测定，也通过使用 ¹ D色谱柱保留时间预测 ² D保留时间进行测定。该方法研究了由色谱柱极性变化引起的组分的特定位移，也显示了组分在有效分离空间的总体分布，即介于死时间和在 ² D上保留最强的化合物。这一方法的缺点在于，计算得到的可用空间取决于混合物中最后馏出的化合物所计算的可用空间上化合物的分布情况。

Cordero等使用了与上述方法相关的实验方法，通过GC×GC分析香精油和标准液的混合物。 ¹ D为两根以OV-1和聚乙二醇为固定相的色谱柱，与涂有这两个固定相混合物和OV-17的 ² D色谱柱进行组合，以这种方式建立了10组不同的色谱柱系统。GC×GC实验结果对应于不同水平的正交度。Cordero等采用不同参数，基于相关性分析、扩展角度β、信息论（IS和PS）以及分离空间的使用百分比，研究已经表明使用非极性色谱柱（ ¹ D）和极性色谱柱（ ² D）的系统可以获得最佳的分离效果，但是混合固定相具有良好的实用正交度，可能是由于升温程序降低了 ² D混合相色谱柱中非极性相互作用。从两组混合物得到的不同参数值体现了正交度依赖于所分析的化合物，因此进行方法开发时，用于评估正交度值和/或可用分离空间的混合物必须包含对分析物预期特性覆盖 n 维范围的所有组分。

Gilar等对这些方法进行了全面的比较，包括方法适用性和不足等，并提出未来仍然需要继续开发适用于正交度评估的新方法。

Zeng等将正交度度量标准分为两部分（Cpert和Cpeaks），然后分别引入2D分离平面的自然峰覆盖百分比和化合物的分布相关性。通过“方格覆盖率”和简单线性回归模型对它们进行了进一步定量评估，克服了以上方法的缺点。

对于更为通用的正交度度量，也可以使用色谱柱的特定参数，而不是分析物的保留数据。溶剂化参数模型使用五个参数来表征色谱柱的保留。这些参数在一个五维空间中，每一列定义为一个向量。如果 θ 为两个列向量之间的夹角，则对于非常相似的一对固定相，cos θ 接近1，而对应于高正交度的色谱柱系统，cos θ 的值接近0。 y3x1uNfV43430KyuAFQYHxtb673CQ78kmzuiMNh9Tmn1ZMy0hlFbdnEWH/ANkAKr