胰岛素信号转导可大致分为几个步骤:(1)胰岛素首先与细胞表面胰岛素受体(IR)结合,激活其口亚基的酪氨酸蛋白激酶(protein Tyrosine kinase,PTK)。(2)PTK磷酸化IRS而使之激活,导致受体本身磷酸化和几种底物蛋白磷酸化。(3)IR底物主要包括不同类型的胰岛素受体底物(IRS),IRS作为一种船坞蛋白(docking protein),与含肉瘤同源区段2 (src homology 2 domain,SH2)结构域的信号分子结合,激活三条信号途径:① PI3K (phosphatidylinositol -3 - kinase)途径;② CAP/ Cbl / Tc10途径;③Ras MAPK途径。(4)蛋白激酶、磷酸酶级联反应。蛋白激酶(pmteinkinase)使蛋白质底物(酶、信号蛋白)磷酸化,并使其活化或失活,如酪氨酸蛋白激酶(TK氨酸/苏氨酸Ser/ Thr)蛋白激酶。磷酸酶(ph ~:sphatase)使蛋白质底物/酶去磷酸化,而将其激活或抑制。(5)生物学效应:刺激GLUT4转位,促进细胞葡萄糖摄取;刺激糖原合成酶GS调节糖原合成等生物学效应:调节细胞的生长、增殖及分化。
胰岛素信号转导的反馈调节与信号转导方向相反,即由最终反应物质到PI3K,再到IRS -1,最后到达信号转导的起始部位IR。
受体是细胞的一类信号转导分子,它的作用第一步是识别(recognition)信号分子,具体地就是和信号分子呈特异结合(specific binding),第二步是将信号转变成细胞的反应,即信号转导(signal transduction)。受体位于质膜、细胞内的膜结构(即细胞器)、胞液或细胞核内,为蛋白质单体、向多聚体或异多聚体都具有配体结合域和转导信号的功能域。受体都必须具备两点:特异结合和效应,受体在信号转导中起总关键作用。
胰岛素受体广泛分布于全身各组织细胞膜,每个细胞约有1000 ~300000个受体,大多数含1万个受体。胰岛素受体是糖蛋白,由2个α亚基及2个β亚基即α
2
β
2
构成,α亚基及β亚基通过- S - S -键相连。α亚基在细胞质膜外表面,分子量130kD,由723个氨基酸残基构成,具有与胰岛素或IGFI及II特异结合的部位。β亚基跨膜存于胞质,分子量95kD,由620个氨基酸残基构成,跨膜时由23个疏水氨基酸形成α螺旋。β亚基具有酪氨酸蛋白激酶活性。β亚基又可分为三区:胞外结构域、跨膜区及胞质结构域。胞质结构域又由含酪氨酸(Y)的三区构成:即近膜结构域(Tyr972)、酪氨酸激酶结构域(_ ryr 1158,Tyr 1162,Tyr 1163)及C末端结构域(Tyr 1328,Tyr 1334),在胰岛素受体信号传递中发挥重要作用。
近膜Tyr -972为胰岛素受体β亚基与胞质内胰岛素受体底物-1(IRS -1)结合所必需,在胰岛素信号的传递上发挥关键作s用。酪氨酸激酶结构域具有ATP结合部位,其中第1030位赖氨酸残基如定向突变,则胰岛素酪氨酸蛋白激酶活性完全丧失。酪氨酸激酶结构域具有3个酪氨酸磷酸化部位(Tyr1158、Tyr 1162及Tyr 1163),当这3个酪氨酸残基同时被磷酸化,受体才被激活,如其中1个或2个酪氨酸被磷酸化,受体活性均较弱。
受体β亚基C末端两个酪氨酸磷酸化部位(Tyr 1328及Tyr 1334)在胰岛素信号传递中的作用尚不清楚,最近发现,此结构域能与信息传递蛋白(adapter protein)Grb -10结合,参与细胞增殖。
此外,在近膜结构域(Ser 967、Ser 968)及C末端结构域(Ser 1305、Ser 1306、Thr 1348)还有丝氨酸及苏氨酸残基,可被PKC磷酸化。曾有研究发现,当胰岛素受体13亚基的丝氨酸、苏氨酸残基被磷酸化,则其酪氨酸蛋白激酶活性下降,然而最近的研究
则未见二者有联系。
胰岛素与靶细胞上的IR结合,将胰岛素信号转入膜内。
α亚基对β亚基受体TK起抑制性调控作用。非活化状态下,TK的催化位点被活化袢掩盖,使其不能与ATP及受体底物接触。当胰岛素与α亚基特异性结合后,其抑制β亚基作用即解除,活化袢上第1158、1162、1163位的酪氨酸残基自身磷酸化,引起构象上的变化。从而使ATP及受体底物能与受体TK的催化位点相接触,而使受体底物蛋白上的酪氨酸残基磷酸化。
图2 -1 胰岛素受体及其活性调节
IR的α亚基结合胰岛素后发生变构,立即通过疏水跨膜区至β亚基变构和受体寡聚化。此时β亚基Tyr1146首先进行自身磷酸化而激活受体TK活性并以此扩散其他酪氨酸残基磷酸化,激发IR信号耦联瀑布。IR自身磷酸化涉及包括跨膜螺旋区、近膜侧区和C末端磷酸化区三个结构域的酪氨酸位点。
IR除了酪氨酸磷酸化外,在近膜结构域(Ser967、Ser968)及C端结构域(Ser1305、Ser1306、Thr1348)的丝氨酸及苏氨酸残基可被PKC磷酸化。受体Ser/ Thr磷酸化的作用与酪氨酸磷酸化相反,对IRTK活性起负面调控作用。
IRS家族包括4 种异构体蛋白,IRS -1,2,3,4。它们具有共同的结构特征,但拥有不同的组织分布和功能。IRS蛋白的激活可募集和活化多种信号转导蛋白,介导IRS和IGF - I等多向性细胞信号转导效应,避免了由多种受体直接招募SH2 类蛋白到它的自身磷酸化位点,因此是一种经济而有效的细胞信号转导方式。通过多种受体分享使用IRS蛋白,胰岛素和其他激素、细胞因子之间进行着重要的联系和功能调节。在目前发现的4 种IRS蛋白克隆中,存在于骨骼肌中的主要是IRS - l。
人、大鼠及小鼠IRS -1的氨基酸序列已确定。IRS -1为亲水性蛋白,具高度保守性,三种不同种属动物间氨基酸序列的同源性高达9O%以上。IRS -1 N末端具有PH (pleekstrin homology,PH)结构域,后者能特异结合磷脂及细胞内其他信号蛋白如Sos、PKB、B - ark等。此外IRS -1还含有与磷酸酪氨酸残基结合(PTS)的结构域,后者可与酪氨酸磷酸化的胰岛素受体结合,从而传递胰岛素的信号。
IRS -1至少含有20个酪氨酸残基可被磷酸化,其中6个在YNXM模体(motif)中,3 个在YXXIM模体中。激活的胰岛素受体至少使IRS -1中8 个酪氨酸残基磷酸化。此外IRS -1 还含有30 个以上的丝氨酸/苏氨酸残基可被丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷酸化。
图2 -2 胰岛素受体底物-1
胰岛素受体底物-1的功能概括地讲主要包括以下2个方面。
1.胰岛素信号的传递与放大:当胰岛素与受体结合,使其B亚基酪氨酸蛋白激酶活化,后者使IRS -1的酪氨酸残基磷酸化。酪氨酸残基磷酸化的IRS -1即转变为含SH2结构域的锚蛋白,可通过其磷酸化酪氨酸残基与SH2蛋白结合,从而激活SH2 蛋白的活性,并将胰岛素信号传递到胞内SH2 蛋白。胞质SI - I2 蛋白包括(磷脂酰肌醇3 -激酶,PI3 - K)的P85亚基,生长因子结合蛋白2 (Grb2)及酪氨酸磷酸酶SHP2等。IRS还可将胰岛素受体信号放大。
2.调控胰岛素信号:已经发现,当IRS -1 的丝氨酸/苏氨酸残基被磷酸化,则抑制胰岛素受体酪氨酸蛋白激酶活性。
胰岛素信号所激发的信号传递途径主要有二:一为Ras - MAP激酶途径,一为PI3 -激酶途径。
当胰岛素或IGF与胰岛素受体结合后,引起受体自身磷酸化,从而使其酪氨酸蛋白激酶活化,后者立即使胞质内IRS -1 及Shc的酪氨酸磷酸化,形成的磷酸酪氨酸残基为含SH2 的Grb2 结合。Grb2 由1 个SH2及2个SH3结构域组成,后者又可与Sos结合并使之活化,激活的Sos即可与质膜上的Ras相结合。Sos具有鸟苷酸交换蛋白(GEF)的作用,可使Ras结合的GDP脱落而结合GTP,使之活化。Ras的下游信息传递是一系列蛋白激酶的级联传递和放大过程。活化的Ras - GTP可与一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Raf -1 的N端结合并使之活化,活化Raf -1的C端再与另一个酪氨酸/苏氨酸蛋白激酶MEK (MAP及ERK kinase)相结合,并使之激活。MEK是一个双功能蛋白激酶,它可结合MAP激酶(mitogen - actived protein kinase,MAPK),并使其第185 位酪氨酸残基及第183位苏氨酸残基同时磷酸化使之激活。活化的MAPK可使许多靶蛋白磷酸化。MAPK的靶蛋白很多,可以是膜结合的蛋白、胞质蛋白,也可是核内蛋白质。MAPK靶蛋白可以是MAPK级联放大过程的上游信息蛋白:Sos、Raf - I、MEK及IRS -1,也可是其下游蛋白激酶如MAPK活化蛋白激酶(MAPKAP Kinase)1及2。可被MAPK磷酸化的核内靶蛋白有:C - Fos、C - Myc、CREB、EIKI及RNA聚合酶II等。通过Ras - MAPK传递途径可促使靶细胞基因表达,导致细胞生长、增殖及分化。
图2 -3 Ras - MAP激酶途径示意图
PI3 - K由110kD (P110)的催化亚基及85kD (P85)的调节亚基构成。调节亚基P85含2 个SH2 结构域,1 个inter - SH2 模体及1 个SH3结构域,SH2结构域位于C末端,能与含磷酸酪氨酸残基的信号分子如IRS -1结合。SH3结构域位于1785亚基的N末端,能与富含脯氨酸的各种信号蛋白结合。PI1O亚基上有两个酶的活性,一个为PI3 - K活性,催化PI3位磷酸化生成PI (3,4,5)三磷酸及PI (3,4)二磷酸;一个为丝氨酸蛋白激酶活性,能催化P85 及IRS -1 丝氨酸残基磷酸化,可能在胰岛素信号传递中发挥负反馈调节作用。
图2 -4 mTOR信号转导途径与PI3K信号转导途径
胰岛素或IGF作用于胰岛素受体后,PI3 - K与酪氨酸磷酸化的IRS- 1结合,刺激其PI10亚基催化活性。当P85 亚基的2 个SH2 结构域均被磷酸化的YMXM占领,则PI3 - K的活性达到最大。
PI3 - K的靶蛋白是蛋白激酶B (PKB)。PKB是Ser/ Thr蛋白激酶家族的成员,其催化结构域与PKA及PKC分别有68%及73%的同源性,故命名为PKB。PKB为单链多肽,其N末端为调节区,其第1 ~106位氨基酸为PH结构域,第148 ~ 411 位氨基酸为激酶域,与其他Ser/ Thr蛋白激酶的催化亚基或结构域具有较高的同源性。当胰岛素及IGF作用于靶细胞时迅速引起PKB的活化。
Stephens等(1998)的研究表明,PKB的活化与PI3 - K的作用有关。
当PI3 - K激活后即可催化细胞质膜上的P1 (4,5)P2 及P1(4),P磷酸化生成P1 (3,4,5)P3 或P1 (3,4)P2,后二者可与PKB的PH结构域结合,使PKB结合在质膜内侧面。膜结合的PKB即为2种蛋白激酶即磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶1及2 (PDK1及PDK2,phosphatidyl - dependent kinasel and 2)的底物。PDK1 及PDK2 依次使PKB308 位苏氨酸及473 位丝氨酸残基磷酸化,从而激活PKB,并使PKB从膜脱落,进入胞质,而对胞质内的靶蛋白发挥作用。
PKB的靶蛋白即PKB的直接底物有:磷酸果糖激酶,与糖酵解的调控有关;糖原合成激酶3 (glyeogen synthase kinase 3,GsK3 ),受PKB磷酸化后GSK3活性降低,再使糖原合成酶因磷酸化减少而活性增加,从而导致糖原合成增加。此外,GSK3与mRNA转录起动的活化也有关。参与细胞凋亡的Bad蛋白也是PKB的底物,PKB使Bad磷酸化而转变成无活性形式,从而抑制细胞凋亡。PKB的另一靶标是核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase,P70S6K),P70S6K是促进蛋白质合成的蛋白激酶,
但目前不能肯定P70S6K是否直接受PKB磷酸化。此外,PKB还与葡萄糖的转运、细胞增殖、分化及细胞周期的调节等有关。
运动能够促进骨骼肌摄取葡萄糖增加,可能是由于引起骨骼肌中调节葡萄糖摄取和转运的关键信号蛋白的表达和/或活性增强,主要体现在以下几个方面。
有关胰岛素受体水平的研究国内外都有大量的报道。有研究表明,大鼠运动训练后骨骼肌胰岛素受体、胰岛素受体底物-1 (IRS -1)和胰岛素受体底物-2 (1RS -2)表达分别下降44%,57%,77%。
尽管训练组骨骼肌IRS -1表达下降,胰岛素刺激的IRS -1酪氨酸磷酸化和IRS -1介导的PI3 -激酶活性却增加了。国内也有类似的研究,糖尿病大鼠训练组较安静组肝细胞膜胰岛素受体最大结合率及浓度均降低
,同样运动训练也并未增加糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素受体结合力。总的来看,运动训练引起骨骼肌胰岛素作用的提高和胰岛素信号转导能力的提高,并伴随有胰岛素信号事件前期蛋白表达的下降。提示运动改善糖尿病胰岛素抵抗并非作用于受体水平,而是作用于胰岛素受体后水平。
PI3 - K是调节葡萄糖转运的重要信号分子,在胰岛素所引起的骨骼肌中葡萄糖转运增强和GLUT4 转位增多的急性效应中起重要作用。Chibalin等发现,啮齿类动物在运动l天或5天后16h,骨骼肌中PI3 -K和PKB活性明显升高,并且这一升高与胰岛素刺激的葡萄糖转运活性的升高相对应。这表明在正常骨骼肌细胞,运动可以通过提高PI3 -K和PKB的活性来增强胰岛素信号转导,从而增加对葡萄糖的摄取。
但在Christ等的实验中发现,肥胖大鼠在运动7 周后,胰岛素刺激的骨骼肌葡萄糖转运增加,但并不伴有PI3 - K与PKB的活性及蛋白表达的增加。
这与Chibalin等的发现相矛盾,可能与实验条件差异有关,如动物模型(Zucker大鼠与Wistar大鼠)、运动方式(跑台与游泳)、运动持续时间(7周与l天组、5 天组)。但也提示在Ⅱ型糖尿病骨骼肌中,运动可能通过影响另外的不同于PI -3K途径的信号传递途径来调节葡萄糖转运。
研究显示,正常人骨骼肌中MAPK家族各成员如ERK、p38MAPK、c - JNK等
及下游信号分子的活性,如MAPK激活蛋白激酶l和2
(MAPK activated protein kinase,MAPKAPK1 /2)在急性运动和耐力运动后均可升高。提示在正常骨骼肌中,运动可通过促进MAPK途径的激活来增强胰岛素作用。对肥胖Zucker大鼠的研究则发现,运动可升高其骨骼肌中ERK2和下游信号分子RSK2的基础活性。并且大鼠在注射胰岛素后进行运动,其ERK2的活性在最大胰岛素浓度刺激时可维持在正常范围以内,即运动提高了ERK2对胰岛素刺激的敏感性,同时ERK2活性的改变与柠檬酸合成酶(直接参与糖代谢)的活性有关,这表明运动所引起的骨骼肌中胰岛素信号转导的增强,至少有一部分是由ERK2介导的。
江钟立等还发现,高血糖状态下,运动可以激活大鼠骨骼肌中的JNK和p38激酶信号转导途径,提示JNK和p38MAPK的激活可能参与了骨骼肌对葡萄糖的摄取、糖原的合成以及胰岛素敏感性改善的调节过程。
今后的研究中,尚需进一步明了MAPK信号传递途径中的下游信号分子及其与运动后糖尿病骨骼肌中GLUT4 等信号蛋白基因表达变化的直接关系。