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脑内神经通路的发育对于行为、心血管和神经内分泌功能都起着非常重要的作用。但是由于技术方法的限制，研究胎儿的中枢神经通路的功能发育一直以来都非常困难。我们这里介绍一种思路或方法，用以检测胎儿的中枢神经通路是否或何时具备功能。这种方法结合了胎儿置管手术和即刻早期基因 c-fos 的检测，并且基于缺乏血脑屏障的脑结构——室周器官（circumventricular organ，CVO）。这是一种很好的实时检测方法（清醒、无应激、无麻醉状态），特别是在检测胎儿CVO和脑内其他区域的神经通路的功能建立方面，有其独到之处。
成年动物研究发现，脑内存在重要的心血管调控神经网络（图2-5）。
图 2-5 中枢心血管调控神经网络示意图
穹隆下器（SFO）、视前正中核（MnPO）、终板血管器（OVLT）、室旁核（PVN）、视上核（SON）、孤束核（NTS）等之间的投射构成神经网络。升压物质如AngⅡ可通过自主神经功能增强（交感激活）、加压素释放、抑制减压反射等途径导致升压反应。
即刻早期基因（包括 c-fos ， c-jun 和 zif268）被公认为神经元激活的指示物。尽管运用即刻早期基因并非新技术，但是用它来检测胎儿脑内神经通路的功能发育却是一种新的思路。
成年动物的CVO和脑内其他核团之间有着丰富的联系。CVO位于第三、四脑室壁上，哺乳动物脑中至少有七个部位被称为CVO，包括穹隆下器（subfornical organ，SFO）、终板血管器（organum vasculosum of the lamina terminals，OVLT）、松果体、正中隆起、垂体后叶、最后区（area postrema，AP）以及脉络丛。其毛细血管有很多窗孔，血脑脊液屏障不完整。CVO的神经元可接受外周的激素及化学信号，进而完成神经化学和神经内分泌功能。其中，SFO、OVLT和AP可监测血液中的渗透压、离子浓度、激素和化学成分的变化，将信息传入中枢。如在脱水或Ang Ⅱ的刺激下，第三脑室前腹侧区[anterior third ventricle，AV3V，包括视前正中核（median preoptic nucleus，MnPO）和（OVLT）]向SON及PVN有功能性投射。
Dr. Xu和Dr. Herbert在1996年曾做过一个实验，将成年大鼠AV3V损毁后，观察24小时脱水引起的神经元激活情况，以 c-fos 表达为标志（图2-6）。实验发现，单侧损毁AV3V（包括OVLT）可以抑制脱水或AngⅡ诱发的同侧SON和PVN的 c-fos 表达。此结果提示SON和PVN对渗透压和AngⅡ的细胞反应需要来自AV3V区域的投射，且此投射是位于同侧的。另外，许多研究表明SFO、OVLT和AP向其他脑内核团也有丰富的投射，如MnPO、弓状核、穹隆旁区、中央杏仁核、终纹床核、蓝斑、红核、延髓腹外侧区、孤束核等。然而，在胎脑中，这些核团之间的功能发育情况，由于技术的限制是很难了解的。我们将胎儿置管手术和即刻早期基因 c-fos 结合起来则使之成为可能。
血脑屏障的结构基础是位于脑室脉络丛的上皮细胞之间的紧密连接和毛细血管内皮细胞之间的紧密连接。胎儿研究表明，在脑发育的早期阶段即出现这些紧密连接，可以有效地限制外周血中的蛋白质分子进入脑和脑脊液。有资料显示在绵羊孕程60%时血脑屏障就对低分子量的氨基酸具有相对不通透性。因此，从孕中期之后，正常生理状况下，许多化学物质包括肽类、激素和神经因子就已经不能透过血脑屏障了。那么胎儿的CVO在对血源性信号分子的感受和整合上就起着关键性的作用。
图 2-6 AV3V单侧损毁对脱水诱发的SON和PVN c-fos 表达的影响
成年大鼠脑左侧OVLT损毁后同侧SON和PVN无 c-fos 表达，而右侧则不受抑制。右侧SON和PVN中的黑点代表细胞激活，以 c-fos 表达为标志。ac：前联合；LV：侧脑室；OC：视交叉。
我们给孕晚期绵羊胎儿进行子宫内插管手术，如前文所述。待恢复4～5天后，给胎儿股静脉注射AngⅡ（3.5μg/kg，10ml），进行心血管等功能监测。实验结束后，取胎脑进行 c-fos 表达检测。结果显示，静脉注射AngⅡ前后，胎儿和母亲的动脉血指标如pH、PO 2 、PCO 2 、血红蛋白、血细胞比容及血浆渗透压或Na + 浓度都无显著变化，均在正常范围内。对照组（静脉注射生理盐水组），在胎儿前脑无或很少有FOS-ir。但是静脉注射AngⅡ（3.5μg/kg）可诱发胎脑某些区域出现较强FOS-ir（图2-7），不仅局限于SFO和OVLT，还表现在SON的强FOS-ir。这提示胎脑CVO和SON之间的中枢神经通路至少在孕晚期已经相对比较完整并已具备功能。
图 2-7 室周器官及其局部回路的主要联系通路的结构示意图
A，B，C分别示胎儿静脉注射AngⅡ后SFO、OVLT和SON的FOS-ir。BBB，血脑屏障。标尺= 0.1mm。
这里介绍的方法可以检测胎儿脑内是否或何时建立具备功能的神经通路。当外周循环中的药物、激素或是其他肽类信号刺激SFO和OVLT等CVO时，如果通路建立则可以向脑内其他部分投射。简单地说，如果不仅仅是SFO和OVLT有细胞激活表现，而且在脑内其他部位也同时可以检测到细胞活动增强，则可以说明在此孕期阶段，胎脑SFO、OVLT和其他部位的神经通路已经建立且具备功能。
显然，这种方法的关键在于这些CVO（如SFO、OVLT和AP）含有特定受体，是激素、递质和其他信号分子的作用和结合位点。例如，它们富含肽类受体或结合位点，包括AngⅡ、心房钠尿肽、降钙素、胆囊收缩素、内皮素、胰岛素、生长抑素、P物质、血管加压素、血管活性肠肽、阿片肽、神经肽Y、甾类物质（如醛固酮、雌激素、糖皮质激素和孕酮）、生物胺（如儿茶酚胺和5-羟色胺）及氨基酸（如GABA和甘氨酸）等。此外，SFO、OVLT等还富含毒蕈碱受体。只要能作用于CVO的外周循环中的化合物足够大，不能通过血脑屏障，我们即可通过用它们来检测胎儿脑内的中枢神经通路的功能建立状况。