一般选用单胎绵羊(总孕程145±5天),根据需要选择不同妊娠阶段,饲养于室内研究专用的不锈钢笼中,灯光照明,明暗各12小时。自由饮水、进食,术前一天禁食。所有实验方案均须符合实验动物保护和管理规定并获得许可。
手术采用严格无菌操作。怀孕母羊肌内注射盐酸氯胺酮(ketaminehydrochloride,20mg/kg)和硫酸阿托品(50 μg/kg)进行麻醉诱导,之后气管插管,呼吸机通以1 L/min 氧气和 3% 异氟烷(isoflurane)进行麻醉维持。母羊一侧股动脉和股静脉插管(ID = 1.8mm,OD = 2.3mm),分别至腹主动脉和下腔静脉。
腹部正中切口,暴露子宫。子宫内手术主要分三部分进行,图2-1为胎羊子宫内手术示意图:
(一)胎羊后肢和腹部手术:选取合适位置,切开子宫,取出胎羊后肢,做一侧股动脉和股静脉插管(ID = 1.0mm,OD = 1.8mm),并放置子宫内导管测定羊水压力;缝合子宫切口;
(二)胎羊头部手术:再次选取适当位置,切开子宫,暴露胎羊头部。侧脑室插管(18 gauge),位置:矢状缝旁开1cm,人字缝前0.5cm,硬脑膜下约0.8cm,当进入侧脑室后可见脑脊液流出;颅骨钻于颅骨上打洞,于顶骨硬脑膜安装脑电极,用螺丝固定,用于皮层电图(electrocorticogram,ECoG)的监测;之后将插管和脑电极用牙科水泥固定于颅骨上;缝合子宫(图2-2A);
(三)胎羊颈部手术:颈部正中切口,进行吞咽电极安装(型号:AS632,Cooner Wire,Chatsworth,CA)于甲状腺部位,食道平滑肌上、下各安装一对电极,用于监测胎儿肌电图,反映胎羊的吞咽状况。
图2-1 子宫内绵羊胎儿插管示意图
(1)一侧股静脉插管(用于外周给药);(2)一侧股动脉插管(用于血压监测、采血);(3)羊水插管(监测羊水压力);(4)侧脑室插管(用于侧脑室给药);(5)脑电极安装(监测皮层电图);(6-8)食道平滑肌三对肌电电极安装(监测胎儿吞咽活动)。
所有插管从母羊一侧腹部打洞穿出,置于固定于腹侧的小包内,术后即刻及3-4天内于静脉内给予抗菌素。母羊每日70mg庆大霉素和1g苯甲异噁唑青霉素(新青二);胎羊每日5mg庆大霉素和30mg新青二。术后恢复四至五天,开始测试。
所有实验在动物清醒状态下进行,妊娠母羊静立于笼中,自由饮水进食(图2-2B)。随机分为对照组和实验组,每组n至少为5。实验采取连续监测,一般先记录1h基础状态(-60~0min),然后进行药物干预(静脉注射或侧脑室注射),之后继续记录1.5~2h(0~90或0~120min)。药物剂量根据文献及前期实验选定。
胎儿体重根据公式推测(Robillard et al.,1979):
胎儿体重(kg)= 0.0961 × 妊娠天数-9.228
实验中,采用生理记录系统连续监测母亲、胎儿的收缩压和舒张压,羊水压力和心率采样频率为500 Hz(图2-3)。胎儿平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)由羊膜腔压力校准。于不同时间点(如-30min、0min、15min、30min、60min、90min)分别由母亲和胎儿的股动脉插管采血约3.5ml。取0.5ml用于测定PO 2 、PCO 2 、血红蛋白(hemoglobin,Hb)及pH,仪器为Nova analyzer(Nova Biochemical,Model pHOx Plus L,Waltham,MA),校正于绵羊深部温度39°C。剩余血液低温离心,分离出血浆,除用于血浆渗透压和电解质浓度的测定外,均于-20°C冻存,以便用于血浆激素测定。所采胎儿血液用等量滤过后母亲血液(测试前抽取)替代,所采母亲血液用等量生理盐水替代。
图2-2 子宫内绵羊胎儿侧脑室插管及功能测试
A:绵羊胎儿侧脑室插管,可见脑脊液流出。B:清醒无麻醉状态下的功能监测。
实验中根据需要动态连续监测ECoG和食道平滑肌肌电图。手术中在胎羊颈部由上而下在甲状腺部位及食道平滑肌上埋设的三对电极可以记录食道平滑肌的肌电图(electromyography,EMG),EMG电活动的出现从上至下有时间上的先后关系(图2-4)。胎儿的ECoG可以分为高电压(high-voltage,HV)低频和低电压(low-voltage,LV)高频时相。大约有5%左右的区域既不属于HV,也不属于LV,被认为是中间ECoG活动。发生在HV和LV时相的吞咽活动,用此时相的吞咽总个数除以其时间段,以每分钟LV或HV的吞咽个数表示。
图2-3 孕羊母亲及胎儿动态生理功能监测
图中所示1-7为7道生理信号连续记录。1,母羊血压;2,胎羊血压;3,羊水压力;4-6,胎羊食管平滑肌肌电图(上,中,下);7,胎羊皮层电图。
图2-4 食管平滑肌肌电图反映的胎羊吞咽活动
图中上、中、下三条曲线分别代表胎羊颈部由上至下(甲状腺部位、颈部食道平滑肌的上和下)埋设的三对电极记录到的食道平滑肌的EMG,EMG电活动的出现从上至下有时间上的先后关系。
实验中收集的母亲和胎儿的血浆采用放射免疫测定方法测定精氨酸加压素(arginine vesoprssin,AVP)和催产素(oxytocin,OT)的浓度。血浆AVP和OT采用Sep-pak C 18 层析柱提取(Waters Associates,Milford,MA)测定。主要步骤如下:血浆样品用1NHCl酸化,慢慢加入层析柱;用0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA))淋洗,去除部分杂质;用洗脱剂(含50% 甲醇和0.1% TFA)将吸附在层析柱上的生物活性肽洗脱下来,收集在塑料指形管中;将洗脱液吹干,低温保存待测。测定时加入一定量的缓冲液溶解,所有样本同时测定。
实验结束后,麻醉动物,方法如前所述。母羊腹部正中切口,切开子宫,暴露胎儿头颈部,做一侧颈动脉插管(16gauge),0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)和4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)灌流5~7min。取出胎脑,用PFA固定12h后,置于20%蔗糖过夜。低温下从前脑到后脑进行冠状切片,厚度20μm。采用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术(avidin-biotin-peroxidase complex technique,简称ABC法)进行FOS蛋白免疫活性(FOS-immunoreactivity,FOS-ir)检测。脑片先在4℃于第一抗体(1∶15000,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)中孵育过夜,轻摇。FOS蛋白的第一抗体为多克隆抗体,来自兔(或小鼠),其作用为抗FOS蛋白的N端序列。继而在第二抗体羊抗兔(或抗鼠)血清(1:400)中孵育1h,之后用Vectastain ABC kit室温下作用1h(Vector Labs,Burlingame,CA),加入1mg/ml盐酸-3,3'-二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride,Sigma)(0.02%H 2 O 2 )。所有脑片铺于载玻片上,用乙醇脱水,加盖玻片并胶水固定。FOS-ir阳性细胞采用盲法于显微镜下计数。
为检测下丘脑视上核(supraoptic nuclei,SON)和室旁核(paraventricular nuclei,PVN)的AVP和OT神经元的FOS免疫活性,有时还需进行FOS-ir和AVP-ir(或OT-ir)的双重免疫染色。基本方法有两种,第一种为FOS蛋白免疫采用普通方法(DAB显色),在进行上述FOS蛋白免疫染色后,将此脑片用AVP或OT抗体(1:5000,Diasorin,USA)孵育过夜,然后给予结合有异硫氰酸荧光素(fluorescein-isothiocyanate)的抗兔抗体(1:200,Vector Laboratories,USA)。另一种方法为,FOS-ir的检测也采用荧光抗体,AVP-ir或OT-ir检测同上,亦采用荧光抗体。最后脑片铺于载玻片上,乙醇脱水,加盖玻片并胶水固定。使用荧光抗体的脑组织切片需在荧光显微镜下观察。
除此之外,部分实验还可进行了FOS-ir和AT1R-ir双重免疫染色,AT 1 R-ir和OT-ir双重免疫染色,AT 1 R抗体1:100(Santa Cruz,CA,USA)。
检测胎脑内的某基因表达水平。以ACE基因在胎羊脑内的mRNA表达谱为例,首先组织研磨后酚氯仿-乙醇沉淀法提取总RNA,用Eppendorf紫外分光光度计测量OD 260 与OD 280 。以OD 260 /D 280 的比值确定RNA的完整性与纯度,以OD 260 值确定RNA的浓度(μg/μl)。用Invitrogen公司试剂盒(SUPERSCRIPTTM First-Strand Synthesis System,Invitrogen,CA)进行逆转录和PCR过程。用Primer3软件设计引物,引物设计时跨越至少两个内含子以保证PCR产物中没有基因组DNA的污染。PCR反应设计两个对照:一是阴性对照(无模板);二是用DNAase处理RNA以确定有无基因组DNA污染的对照组。引物序列如下:
上游引物:5’CTGCAGTACAAGGACCAGCA 3’
下游引物:5’CGTCAAAGTGGGTTTCGTTT 3’(扩增产物349bp)
ACE基因的PCR反应条件:预变性,94℃×5min;变性94℃×1min,复性60℃×1min,延伸72℃×1min,循环数35;延伸,72℃×7min。内参18S的PCR反应的循环数为28,其余同上。1.5%琼脂糖凝胶电泳记录结果,用IS-1000 数字成像系统(version 2.00,Alpha Innotech,CA)扫描定量。
脑内神经通路的发育对于行为、心血管和神经内分泌功能都起着非常重要的作用。但是由于技术方法的限制,研究胎儿的中枢神经通路的功能发育一直以来都非常困难。我们这里介绍一种思路或方法,用以检测胎儿的中枢神经通路是否或何时具备功能。这种方法结合了胎儿置管手术和即刻早期基因 c-fos 的检测,并且基于缺乏血脑屏障的脑结构——室周器官(circumventricular organ,CVO)。这是一种很好的实时检测方法(清醒、无应激、无麻醉状态),特别是在检测胎儿CVO和脑内其他区域的神经通路的功能建立方面,有其独到之处。
成年动物研究发现,脑内存在重要的心血管调控神经网络(图2-5)。
图 2-5 中枢心血管调控神经网络示意图
穹隆下器(SFO)、视前正中核(MnPO)、终板血管器(OVLT)、室旁核(PVN)、视上核(SON)、孤束核(NTS)等之间的投射构成神经网络。升压物质如AngⅡ可通过自主神经功能增强(交感激活)、加压素释放、抑制减压反射等途径导致升压反应。
即刻早期基因(包括 c-fos , c-jun 和 zif268)被公认为神经元激活的指示物。尽管运用即刻早期基因并非新技术,但是用它来检测胎儿脑内神经通路的功能发育却是一种新的思路。
成年动物的CVO和脑内其他核团之间有着丰富的联系。CVO位于第三、四脑室壁上,哺乳动物脑中至少有七个部位被称为CVO,包括穹隆下器(subfornical organ,SFO)、终板血管器(organum vasculosum of the lamina terminals,OVLT)、松果体、正中隆起、垂体后叶、最后区(area postrema,AP)以及脉络丛。其毛细血管有很多窗孔,血脑脊液屏障不完整。CVO的神经元可接受外周的激素及化学信号,进而完成神经化学和神经内分泌功能。其中,SFO、OVLT和AP可监测血液中的渗透压、离子浓度、激素和化学成分的变化,将信息传入中枢。如在脱水或Ang Ⅱ的刺激下,第三脑室前腹侧区[anterior third ventricle,AV3V,包括视前正中核(median preoptic nucleus,MnPO)和(OVLT)]向SON及PVN有功能性投射。
Dr. Xu和Dr. Herbert在1996年曾做过一个实验,将成年大鼠AV3V损毁后,观察24小时脱水引起的神经元激活情况,以 c-fos 表达为标志(图2-6)。实验发现,单侧损毁AV3V(包括OVLT)可以抑制脱水或AngⅡ诱发的同侧SON和PVN的 c-fos 表达。此结果提示SON和PVN对渗透压和AngⅡ的细胞反应需要来自AV3V区域的投射,且此投射是位于同侧的。另外,许多研究表明SFO、OVLT和AP向其他脑内核团也有丰富的投射,如MnPO、弓状核、穹隆旁区、中央杏仁核、终纹床核、蓝斑、红核、延髓腹外侧区、孤束核等。然而,在胎脑中,这些核团之间的功能发育情况,由于技术的限制是很难了解的。我们将胎儿置管手术和即刻早期基因 c-fos 结合起来则使之成为可能。
血脑屏障的结构基础是位于脑室脉络丛的上皮细胞之间的紧密连接和毛细血管内皮细胞之间的紧密连接。胎儿研究表明,在脑发育的早期阶段即出现这些紧密连接,可以有效地限制外周血中的蛋白质分子进入脑和脑脊液。有资料显示在绵羊孕程60%时血脑屏障就对低分子量的氨基酸具有相对不通透性。因此,从孕中期之后,正常生理状况下,许多化学物质包括肽类、激素和神经因子就已经不能透过血脑屏障了。那么胎儿的CVO在对血源性信号分子的感受和整合上就起着关键性的作用。
图 2-6 AV3V单侧损毁对脱水诱发的SON和PVN c-fos 表达的影响
成年大鼠脑左侧OVLT损毁后同侧SON和PVN无 c-fos 表达,而右侧则不受抑制。右侧SON和PVN中的黑点代表细胞激活,以 c-fos 表达为标志。ac:前联合;LV:侧脑室;OC:视交叉。
我们给孕晚期绵羊胎儿进行子宫内插管手术,如前文所述。待恢复4~5天后,给胎儿股静脉注射AngⅡ(3.5μg/kg,10ml),进行心血管等功能监测。实验结束后,取胎脑进行 c-fos 表达检测。结果显示,静脉注射AngⅡ前后,胎儿和母亲的动脉血指标如pH、PO 2 、PCO 2 、血红蛋白、血细胞比容及血浆渗透压或Na + 浓度都无显著变化,均在正常范围内。对照组(静脉注射生理盐水组),在胎儿前脑无或很少有FOS-ir。但是静脉注射AngⅡ(3.5μg/kg)可诱发胎脑某些区域出现较强FOS-ir(图2-7),不仅局限于SFO和OVLT,还表现在SON的强FOS-ir。这提示胎脑CVO和SON之间的中枢神经通路至少在孕晚期已经相对比较完整并已具备功能。
图 2-7 室周器官及其局部回路的主要联系通路的结构示意图
A,B,C分别示胎儿静脉注射AngⅡ后SFO、OVLT和SON的FOS-ir。BBB,血脑屏障。标尺= 0.1mm。
这里介绍的方法可以检测胎儿脑内是否或何时建立具备功能的神经通路。当外周循环中的药物、激素或是其他肽类信号刺激SFO和OVLT等CVO时,如果通路建立则可以向脑内其他部分投射。简单地说,如果不仅仅是SFO和OVLT有细胞激活表现,而且在脑内其他部位也同时可以检测到细胞活动增强,则可以说明在此孕期阶段,胎脑SFO、OVLT和其他部位的神经通路已经建立且具备功能。
显然,这种方法的关键在于这些CVO(如SFO、OVLT和AP)含有特定受体,是激素、递质和其他信号分子的作用和结合位点。例如,它们富含肽类受体或结合位点,包括AngⅡ、心房钠尿肽、降钙素、胆囊收缩素、内皮素、胰岛素、生长抑素、P物质、血管加压素、血管活性肠肽、阿片肽、神经肽Y、甾类物质(如醛固酮、雌激素、糖皮质激素和孕酮)、生物胺(如儿茶酚胺和5-羟色胺)及氨基酸(如GABA和甘氨酸)等。此外,SFO、OVLT等还富含毒蕈碱受体。只要能作用于CVO的外周循环中的化合物足够大,不能通过血脑屏障,我们即可通过用它们来检测胎儿脑内的中枢神经通路的功能建立状况。
系统性RAS对体液及心血管平衡具有重要的调节作用。肾素是由肾球旁细胞合成和分泌的一种酸性蛋白酶,经肾静脉进入血循环。血浆中的肾素底物,即由肝脏合成和释放的血管紧张素原,在肾素的作用下水解,产生一个十肽,为AngⅠ。在血浆和组织中,特别是在肺循环血管内皮表面,存在有ACE,在后者的作用下,AngⅠ水解,产生一个八肽,为AngⅡ。AngⅡ在血浆和组织中的氨基肽酶A的作用下,再失去一个氨基酸,成为七肽AngⅢ。RAS的生理功能主要是对体液平衡、摄盐和血压的调节,特别是在体内细胞外液量减少和血压降低的情况下通过调节血流阻力和肾脏排钠量,使器官组织仍能得到一定的血液灌注。
近年的研究证实,除了上述全身性的RAS外,在脑和其他一些器官中,如肾脏、肾上腺、心脏、血管壁等,也存在RAS的各个组成成分,总称为肾外RAS。脑内RAS的功能主要也是参与对水、盐平衡和血压的调节,并引起渴觉、饮水和钠需求。研究表明,脑RAS不依赖于全身性的RAS,而是独立存在的。对体内多数组织、细胞来说,AngⅡ是血管紧张素中最重要的活性物质。血管平滑肌、肾上腺皮质球状带细胞以及脑、心脏和肾脏等器官的细胞上存在血管紧张素受体。AngⅡ与血管紧张素Ⅱ受体(angiotensin Ⅱ receptor,ATR)结合,引起相应的生理效应。依据ATR对洛沙坦(losartan,AT 1 R特异性拮抗剂)和PD123177(AT 2 R特异性拮抗剂)结合特性的不同,将ATR主要分为两型:AT 1 R和AT 2 R。在成年动物,AngⅡ通过AT 1 R介导血管和心脏的收缩、促进醛固酮、AVP、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)等激素的合成和释放;通过AT 2 R介导抑制细胞生长,促进细胞凋亡、细胞分化、血管舒张等。
近年来,研究还发现了RAS的许多新组分,如肾素原受体,血管紧张素1-7[Ang(1-7)],血管紧张素转化酶2(ACE2)及G蛋白耦联受体Mas等,这使得RAS远比人们先前了解的复杂得多。其中ACE2是2000年发现的一种ACE的同源体。与ACE的全身广泛分布不同,ACE2 主要分布于心脏、肾脏和睾丸,即主要位于心脏和肾脏血管的内皮细胞,在远端肾小管的上皮细胞和冠状血管、肾内血管的平滑肌细胞也有少量分布。后来还在胃肠道、脑、肺里发现有少量ACE2。ACE2与ACE既有相同的底物(其中最重要的是AngⅠ),也有不同的底物。ACE2为单羧肽酶,仅有一个酶活性位点,作用于底物的脯氨酸和疏水氨基酸之间,它仅能水解AngⅠ的羧基端亮氨酸残基,生成九肽的血管紧张素1-9[Ang(1-9)];而ACE是一种二肽酶,它每次可以从底物的羧基端裂解掉一个二肽。Ang(1-9)也是ACE的底物,能竞争性抑制ACE其他底物,在ACE的作用下能转化成有活性的七肽Ang(1-7),如图3-1。另外,ACE2还能水解AngⅡ,脱去它的一个羧基端残基,生成Ang(1-7)。体外实验表明,ACE2水解AngⅡ的活性是AngⅠ的400多倍。Ang(1-7)可结合于Mas受体,使血管扩张,对心血管系统有着良好的调节作用。ACE2-Ang(1-7)-Mas构成一个功能轴,它的作用与以往研究较多的ACE-AngⅡ-AT 1 R功能轴相反。许多研究发现,ACE2-Ang(1-7)-Mas对心血管疾病有预防和治疗作用。
图 3-1 肾素-血管紧张素系统结构示意图
血管紧张素原(angiotensinogen)在肾素(renin)的作用下被转变成血管紧张素I(Ang I)。Ang I继而在血管紧张素转化酶(ACE)的作用下被转变成血管紧张素Ⅱ(AngⅡ),或者是在血管紧张素转化酶2(ACE2)的作用下转变成Ang(1-7)。ACE2也可以裂解Ang I转变成Ang(1-9),然后再在ACE作用下转变成Ang(1-7)。Ang Ⅱ作用于AT 1 R产生生理和病理反应。Ang(1-7)则可作用于Mas受体,减弱ACE-Ang Ⅱ-AT 1 R功能轴的作用。实线和虚线分别代表正性和负性作用。ACE-I:ACE抑制剂;ARB:AT 1 R阻断剂。