第三节
影响核呼吸基因的线粒体信号

哺乳动物细胞内线粒体是ROS产生的主要场所及钙库存在部位。线粒体功能改变导致的细胞氧化还原状态平衡变化可能参与线粒体与细胞核的交互作用。

一、Ca ^2＋ 及ATP的转运

胞浆中钙离子浓度的提高对核和线粒体基因mRNA的调节水平不同，可提高肌肉中线粒体含量 ^[45] 。每一次动作电位的产生均伴有Ca ^2＋ 的释放，Ca ^2＋ 作为第 2信使，可激活诸多磷酸酶和／或激酶，如钙／钙调蛋白激酶IV（Calcium／Calmodulin-Dependent Protein Kinase IV，CaMK IV）、蛋白激酶C（Protein Kinase c，PKC）和钙调磷酸酶（Cn）等。这些酶最终转位至核中，影响转录因子活性与编码线粒体蛋白核基因的表达 ^[46] 。CaMK介导了骨骼肌因收缩活动引起的基因调节和线粒体生物合成。对骨骼肌中选择性表达CaMK IV的转基因小鼠研究发现，小鼠骨骼肌出现明显的线粒体增殖 ^[47] 。钙调磷酸酶A （CnA）为丝氨酸-苏氨酸磷酸酶，它的磷酸酶活性受钙离子调控，CaM与Cn可形成复合体，钙离子与CaM-Cn复合体相结合，激活Cn。骨骼肌和心肌在收缩与放松的交替过程中，胞浆中钙离子水平出现大幅度波动，胞浆中钙离子间歇性升高，刺激线粒体生物合成 ^[48] 。人为地用钙离子载体改变肌细胞中钙离子水平，能可逆性地使肌球蛋白构型向慢肌类型转化，并伴有线粒体酶活性升高 ^[49] 。CaMK IV和CnA活性均可调节PGC-1 α 的启动子。CaMK IV主要通过与cAMP反应元件结合蛋白（CREB）结合，激活PGC-1 α 的启动子。CnA对激活人体骨骼肌PGC-1的转录活性也起一定作用。在PGC-1 α 和MEF2家族的某些分子之间存在正反馈环路，特别是被PGC-1 α 共同活化时，MEF-2s能结合到PGC-1 α 启动子上并激活它。MEF-2又由CnA激活。因此，可能存在一个共同的途径，使钙信号关键调节子与PGC-1 α 转录性转化形成一个自动调节环 ^[38] 。

有报道称，肌细胞经Ca ^2＋ 载体A23187处理后胞浆Ca ^2＋ 浓度增加，导致Ca ^2＋ 敏感的PKC依赖信号通路介导的细胞色素C基因表达增加 ^[50] 。有关转基因鼠的研究发现，对骨骼肌特异组分有效的CaMK IV可以引起转基因鼠骨骼肌线粒体生物合成增加，提示cAMP反应元件绑定蛋白（CREB）介导Ca ^2＋ 依赖的线粒体基因表达调控。而且，实验表明PGC-1 α 水平和线粒体含量增加依赖于CaMK IV ^[47] 和AMP激酶 ^[51] 的活性，它们分别受胞内Ca ^2＋ 浓度和ATP／AMP比率改变的调节。这些研究结果提示参与线粒体含量调节的PGC-1 α 和其他因子的活性和基因表达可以被靶细胞内能够感知胞内Ca ^2＋ 水平和能量状态改变的效应蛋白进一步调控。然而，生理条件下肌肉收缩产生上述变化所需的Ca ^2＋ 信号的变化幅度，持续时间和短暂模式还需进一步研究。

二、NO

最近的实验发现，NO作为重要信使，可激活许多细胞系的线粒体生物合成，并可通过cGMP依赖和非cGMP依赖两种途径实现调控。暴露在寒冷环境中和运动均可通过激活β3肾上腺素受体产生NO，提高胞内cGMP和Ca ^2＋ 含量，诱发PGC-1表达 ^[52，53] 。eNOS-／-小鼠暴露在寒冷环境中，其体内线粒体数目未增加。另外NO还能可逆地调节COX活性。NO／cGMP激活PGC-1 α 和／或NRF-1的精确机制尚有待阐明。骨骼肌细胞线粒体内部有自己的mtNOS存在，可直接抑制氧耗和ATP合成，调节线粒体能量产生。另外，线粒体中NO的增加还可调节线粒体中钙离子的浓度。胞浆中钙离子的浓度是否影响线粒体的生物合成，有待今后的研究证实。

三、AMPK

力竭性运动时能量代谢紊乱会导致ATP的耗竭。能量产生变化或磷酸化势能改变，可引起代偿性反应，最终导致线粒体含量增加。但在中等强度运动训练时，细胞内ATP水平无明显改变，也可出现线粒体的生物合成增加。因此，尽管普遍认为ATP耗竭可导致线粒体数量增加，其实很可能是只要ATP周转加快，便足以诱发线粒体增殖 ^[54] 。大鼠骨骼肌中AMPK活性与线粒体中酶含量的上升及生物合成过程相关联，AMPK可因ATP／AMP比率和磷酸肌酸含量的下降而激活。在肌肉收缩中，AMPK激活可提高GLUT4的转运，促进葡萄糖转运和脂肪酸氧化，抑制乙酰CoA羧化酶，从而有助于预防能量产生不足 ^[55，56] 。长期运动训练可通过对AMPK活性的反复刺激，提高骨骼肌适应性。AMPK的长期活化可将信号传递给低耗能状态下的肌细胞，激发与能量产生有关的酶的基因表达上调 ^[57] 。许多研究表明，在调控线粒体生物合成的过程中，有一条AP-1和AMPK与NRF-1的协同作用途径。运动中AMPK活化参与了对骨骼肌代谢的调节，在跑台或测力计上以有氧阈强度以上运动 30min，可诱导出人体股外侧肌Jun／Fos家族转录子的表达 ^[58] 。Jun和Fos蛋白结合成二聚体AP-1，成为启动子，影响其他几种核编码的线粒体蛋白启动子活性，这些线粒体蛋白包括细胞色素c等，它们直接受运动影响。人股外侧肌AMPK的 α 2同构体，在测力计训练中以强度依赖形式被激活 ^[59] 。钙信号和AMPK- α 的活性直接影响PGC-1 α 蛋白含量的提高，并通过翻译后的磷酸化事件提高PGC-1 α 蛋白的稳定性。AMPK活性与NRF-1结合位点活性的提高，细胞色素含量的增加以及肌细胞中线粒体密度的增加有关联。线粒体增殖中，AMPK似乎是细胞应答代谢性刺激的关键开关，并介导了对代谢产生反应的其他信号途径 ^[60] 。AMPK还激发了eNOS的活性 ^[61] 。

四、活性氧（ROS）

活性氧（ROS）常指氧自由基及其衍生物，这类衍生物主要有过氧化氢（H ₂ O ₂ ）、单线态氧（IO ² ）、脂质自由基（L O·）、脂质过氧自由基（LOO·）、有机过氧化物（LOOH）等。其中过氧化氢并非自由基，但由于它具有强氧化性质，对生物体的作用也类似自由基，所以常在文献中一起加以讨论。在生物体内，其代谢过程中不断生成的内源性自由基，逐步被体内的抗氧化系统一一清除。因此，在生理状态时体内自由基常保持在低浓度有利无害的动态平衡中，只有有机体处于某些特殊的生理或病理状态时，体内的自由基生成速率才大于清除速率，以致自由基浓度升高，有时甚至可以达到对机体中细胞或运动能力产生损害的水平 ^[62] 。

众所周知，电子传递链中NADH脱氢酶和质子驱动的Q循环是诸如超氧阴离子和H ₂ O ₂ 等ROS频繁产生的重要位点 ^[63] 。正常生理条件下，组织细胞中 1％～5％的线粒体氧耗用于产生ROS ^[64] 。而且，呼吸链功能缺陷时线粒体产生的超氧阴离子增加，这在线粒体疾病患者 ^[65] 和衰老个体 ^[66] 受损组织中可以观察到。

目前认为，ROS不仅是氧化应激的始动因素，而且ROS作为一种信号分子在细胞的增殖、分化、死亡以及机体的免疫应答、衰老等过程中起着重要的作用。新近的研究表明，在线粒体呼吸链ROS产生过量时，可激活线粒体内膜上的解偶联蛋白（UCPS、UCP2或UCP3），作为一个反馈性的应答并通过UCPS轻度的解偶联作用降低ROS的生成，保护线粒体免受氧化损伤。ROS作为信号分子在调节细胞氧化还原信号转导、氧化还原电势和ATP利用与合成平衡中具有重要生物学意义。

已经观察到人类细胞可通过H ₂ O ₂ 依赖的信号通路促进核与线粒体基因的表达从而对有缺陷的线粒体呼吸功能作出应答。一项mtDNA缺乏的ρo细胞研究显示胞内ROS增加与NRF-1和mtTFA高表达同时发生。此外，人类肺MRC-5细胞经亚致死量的抗菌霉素A处理后，胞浆ROS的增加引起细胞线粒体含量的增加。这些结果支持ROS在线粒体到细胞核的信号传导中发挥重要作用的观点。多条信号通路对ROS过度产生引起的氧化应激产生应答。AP-1和NF-κB是早已确立的对氧化应激反应的转录因子。电刺激可以通过C-jun氨基末端激酶和NRF-1介导的AP-1信号通路诱导细胞色素C氧化酶亚基Va和细胞色素C的表达 ^[68] 。然而，ROS可能并不介导电刺激引起的呼吸链基因表达增加。很少有证据表明AP-1和NF-κB的转录活性与呼吸基因或者呼吸基因转录调节子间有直接的联系。

五、MAPK及其p38MAPK级联通路

肌肉收缩的机械性刺激主要通过MAPK家族中的 3支途径（ERK1／2，JNK和p38）对转录前的调控产生作用 ^[69，70] 。这些激酶的活化影响了Jun／Fos和ATF／CREB家族的转录因子，使转录子结合到C-Jun、C-Fos和细胞色素c等基因的启动子上。骨骼肌细胞中p38途径只有在机械性应激（如肌肉牵伸和运动）时出现反应 ^[71] 。研究表明，单独的机械应力即可调节细胞的生长和代谢，胞内信号蛋白在其中起重要作用。离体肌肉伸长后，JNK活性和p38磷酸化升高，表明其为细胞活性的主要刺激因素。JNK磷酸化程度依赖于机械应力的大小，说明MAPK在将机械刺激传递至细胞核及在启动线粒体增殖过程中有一定作用。在被动伸长过程中，伸长幅度变化可很快诱导出C-Jun和C-Fos基因表达也支持这一观点 ^[72] 。新生大鼠心肌细胞对应激产生应答的过程中，p38磷酸化了PPAR α N-端A／B结构域中的丝氨酸残基。因此PPAR α 作为p38激酶依赖的效应因子，将胞外的应激原和与能量代谢相关的基因表达改变联系了起来 ^[73] 。

有报道称p38MAPK敏感的信号通路可以激活PGC-1，而且PPAR α 基因表达依赖于p38MAPK的活化。

P38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK）家族的重要成员，是哺乳动物信号通路中的另一条经典途径，由Brester等 1993年在不同实验中发现 ^[75] 。目前资料表明，p38MAPK存在 6种异构形式，即p38MAPK α 1／ α 2、p38MAPKβ1／β2、p38MAPKγ和p38MAPKδ。不同的p38MAPK异构体（或亚型）在组织分布、上游激酶调节、下游作用底物以及对细胞外刺激的反应都各有不同，其中p38MAPK α 和p38MAPKβ在各种组织普遍表达，p38MAPKγ主要存在于骨骼肌肉中，p38MAPKδ则多见于睾丸、胰腺、前列腺、小肠、唾液腺、肺组织、垂体和肾上腺等处 ^[76] 。不同异构体对底物的作用选择性和它们之间细胞特异性可能影响着细胞信号传导的特殊性。而且在同一细胞内也可能存在着不同的p38异构体，这些不同异构体在细胞内定位的差异可能是p38MAPK在不同细胞内介导不同生物学效应的机制之一。

MAPK的激活是通过一个接近激活位点为“T环结构”（T-loop）的表面环状结构上的三肽基“TXY”中邻近的酪氨酸（T）和苏氨酸（Y）的磷酸化来完成，T环是决定包括各种MAPK在内的多种蛋白激酶活性的关键结构。其中，为隔开两磷酸化位点的氨基酸，不同MAPK亚族间X不同，其T环的长度也不同。p38MAPK级联反应包括 4种激酶：PAK （p21-activated kinase，MAPKKKK）、MLK （MAPKKK、MKKK／MEKK）、MKK3／6／4（MAPKK、MKK／MEK）、p38MAPK （MAPK），它们构成了一个连续的蛋白激酶反应链。细胞外信号与受体特异性结合后，通过磷酸化PAK和MLK（主要为MLK3），促进MKK3／MKK6基因表达，并使其表达蛋白磷酸化，进而诱导p38MAPK基因转录，提高其生物功能，活化的p38MAPK通过上调APF2、CHOP10、MEF2C等转录因子基因的表达和生物活性，影响细胞的增殖、分化和细胞因子的合成 ^[77] 。

紫外线照射、促炎细胞因子（TBF- α 、IL-1）、应激刺激（H ₂ O ₂ 、热休克、高渗环境、蛋白合成的抑制剂、缺血／再灌注等）以及脂多糖（LPS）细菌病原体及其产物均可激活p38MAPK ^[78] 。

研究发现，在长时间剧烈运动（如马拉松）后，属于SAPK的p38MAPK和JNK以及它们的上游激酶MEK4（ERK激酶 4）和MEK6均有一过性升高，说明SAPK级联也参与了骨骼肌对激烈运动的反应。马拉松跑后p38MAPKγ的磷酸化可以升高 4倍，但p38MAPK α 的磷酸化和活性均无变化 ^[79] 。70％ max强度运动 30min后就会有p38MAPK磷酸化的升高并持续 60min，p38MAPK磷酸化在运动停止后的工作肌中也有增加，表明运动诱发的p38MAPK磷酸化是由局部和整体共同调节的，但它的循环特性还有待于证实 ^[80] 。

在细胞因子等外源性因子诱导线粒体增殖的过程中，p38MAPK依赖的信号通路对呼吸基因表达的调控可能发挥重要的作用。Kralli等研究也发现，p38MAPK的激活能增加PGC-1的转录活性。他们假设有一种抑制物结合于PGC-1的LXXLL基序，当p38MAPK的磷酸化作用发生时，抑制物和LXXLL基序解离 ^[81] 。另外，研究还发现PPAR α ／PGC-1的转录活性能被p38MAPK通路激活，这在心脏应激过程中可能具有生理学意义 ^[73] 。最新研究发现，p160 myb结合蛋白，也称为p160MBP，能与PGC-1的上述负调节结构域相结合，降低PGC-1的转录活性。p38MAPK对PGC-1的正调节作用机制正是通过解除p160MBP与PGC-1的负调节结构域结合，从而消除其负调节作用 ^[82] 。细胞因子或者β肾上腺素能信号能促进细胞中p38MAPK活化，对PGC-1的 3个氨基酸残基进行磷酸化作用，之后PGC-1与其负调节结构域结合的p160MBP分离，同下游核受体分子发生对接，进而招募形成具有HAT活性的辅激活复合物，改变核小体的相对位置和靶基因的染色质构象，促进RNA聚合酶Ⅱ复合物向靶基因下游行进，从而促进转录起始过程。

然而，p38MAPK依赖的信号通路与氧化应激诱导线粒体含量增加间的联系还未确立。最近一项研究用LPS诱导小鼠肝脏损伤，活化的PI3K-Akt通路偶联ROS信号导致肝脏线粒体生物合成增加。研究发现，氧化剂处理可以上调Akt表达，叔-丁基过氧化氢处理小鼠Akt活性增加，活化的PI3K通路介导这一过程。而且，研究还发现抑制PI3K和Akt的磷酸化可以导致NRF-1绑定蛋白活性抑制，从而明确PI3K／Akt通路与NRF-1的激活有关 ^[83] 。因此，PI3K-Akt的活化可能在氧化应激诱导哺乳动物细胞线粒体生物合成中发挥重要作用。

近来大量不同种类细胞的研究显示，提高的NO水平可以通过一种可溶性的对鸟苷酸环化酶敏感且GMP依赖的信号通路上调PGC-1 α 的表达刺激线粒体生物合成。而且，活体中内皮型的一氧化氮合酶基因的靶向断裂可以导致线粒体含量的显著下降 ^[58] 。这些结果提示，多种类型的哺乳动物细胞调节线粒体数量的信号通路存在保守机制。然而，氧化应激反应下哺乳动物细胞调节线粒体生物合成的过程中，这种信号级联是否代表了普遍存在的机制还需要进一步深入研究。 3M+PoVzA6wv9spJF976k2NLxyJVFjE9qlii4G2qczZu6g5c7AskdSx8+pRHtDLlH