降钙素基因相关肽对运动心脏重塑和保护作用机制的研究最新章节_潘孝贵著

1.6 实验方法

1. 6. 1 血清CGRP浓度的测定

采用酶联免疫吸附法（（ELISA）。测试原理（双抗夹心法）：以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。将特异性的抗体包被在聚苯乙烯微量滴定板孔的内壁上，加入标准品或检测样品后孵育，样本中的CGRP即与固相膜上的抗体结合，洗去未结合的反应物，加入显色剂孵育，上酶标仪读每个反应孔的颜色。通过特定的程序或按照公式推算出待测样品的CGRP含量。试剂盒由美国Cayman公司提供，深圳晶美生物工程公司经销。预实验结果显示， CGRP标准品反应后的吸光度与初始浓度具有线性关系，确定系数R ² 达到 0. 970， p<0. 01，回归方程Y= 0. 275X-1. 45，见图 2-2。主要操作步骤：

（1）洗板：用洗涤缓冲液洗板 5 次。

（2）加样前，倒立滴定板，甩去液体。

（3）按照预先设计的规格加标准品和样品 100μl。

（4）每孔加显色剂 100μl乙酰胆碱酶试剂，4℃避光孵育 24h。

（5）翻转滴定板，轻轻甩去液体，洗涤缓冲液洗 3 次。

（6）每孔加Ellman氏试剂 200μl，暗室，室温振荡 60min。

（7）置酶标仪上，410 nm读数，自动打印结果。

（8）根据设计好的程序或标准曲线，推算样本中CGRP含量。

图 2-2 CGRP标准曲线

1. 6. 2 心肌组织CGRP免疫反应产物分布和表达

采用免疫组织化学法。心脏组织标本经 4%多聚甲醛溶液固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。每组各随机取蜡块 10 只，每只蜡块切片后隔 5 取 1 捞片 10 张，切片厚 5μml。每组共取切片 100 张，将石蜡切片贴于涂有明胶铬矾的载玻片上，37℃恒温箱烤干备用（时间大于 24h）。采用武汉博士德生物工程有限公司生产即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒及DAB显色试剂盒，严格按照使用说明书操作。具体步骤如下：

（1）切片常规脱蜡至蒸馏水；

（2）3% H ₂ O ₂ 室温孵育 10min，阻断内源性过氧化物酶活性；

（3）蒸馏水洗 3 次；

（4）滴加复合消化液室温湿盒孵育 10min，暴露抗原；

（5）蒸馏水洗 3 次；

（6）滴加正常兔血清封闭液，室温湿盒孵育 20min，减少非特异性背景染色；

（7）滴加一抗（1 颐400 山羊抗人CGRP） 4℃湿盒内孵育 48 h，抗原与抗体充分结合；

（8）0. 01M PBS （pH = 7. 4）洗 2min×3 次；

（9）生物素化二抗（兔抗山羊IgG） 37℃湿盒内孵育 20min；

（10）0. 01M PBS （pH = 7. 4）洗 2min×3 次；

（11）加试剂SABC37℃湿盒内孵育 20min；

（12）0. 01M PBS （pH = 7. 4）洗 5min×4 次；

（13） DAB显色：室温显色，镜下控制反应时间，1 ~ 4min蒸馏水中止反应；

（14）蒸馏水洗；

（15）常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1. 6. 3 心室肌CGRP含量测定

采用放射免疫法。取-70℃冷冻的左心室心肌组织 100 ~ 200 mg，放入 0. 1N1ml冰醋酸研磨，在电动匀浆器 10000r/ min匀浆 2 ~ 3 次，4℃，3000 rpm低温离心 15min，取上清-20℃保存。测定时用 0. 1M的PBS 5 倍稀释，以调节pH值。试剂盒由解放军总医院科技开发中心放射免疫研究所提供。本实验采用非平衡法，取 1. 5ml试管，编号，按照表 2-3 操作。

表 2-3 CGRP放射免疫（RIA）测试程序（单位：μl）

充分混匀，室温放置-20min后，4℃3500 rpm离心 25min，取上清液，在酌计数器上测定CPM数。通过预先编制的程序，直接给出CGRP浓度。用CGRP标准品绘出的标准曲线可以看出， CGRP浓度的对数与结合率比值的对数成直线关系，确定系数R ² 为 0. 897， p<0. 01.回归方程： Y= -0. 22X + 3. 22。见图 2-3。

图 2-3 CGRP放射免疫测定标准曲线

1. 6. 4 背根神经节CGRP分布与表达

采用免疫组织化学法（SABC法）。背根神经节标本经 4%多聚甲醛溶液固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。每组各随机取蜡块10 只，切片厚 5μml，每只蜡块切片后隔 5 取 1，捞片 10 张。每组共取切片 100 张，将石蜡切片贴于涂有铬矾明胶的载玻片上，37℃恒温箱烤干备用（时间大于 24h）。采用武汉博士德生物工程有限公司生产即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒及DAB显色试剂盒，严格按照使用说明书操作，具体步骤如下：

（1）切片常规脱蜡至蒸馏水；

（2）3% H ₂ O ₂ 室温孵育 10min，阻断内源性过氧化物酶活性；

（3）蒸馏水洗 3 次；

（4）滴加复合消化液室温湿盒孵育 10min，暴露抗原；

（5）蒸馏水洗 3 次；

（6）滴加正常兔血清封闭液室温湿盒孵育 20min，减少非特异性背景染色；

（7）滴加一抗（1 颐400 山羊抗人CGRP） 4℃湿盒内孵育 48 h；

（8）0. 01M PBS （pH = 7. 4）洗 2min×3 次；

（9）生物素化的二抗（兔抗山羊IgG） 37℃湿盒内孵育 20min；

（10）0. 01M PBS （pH = 7. 4）洗 2min×3 次；

（11）加试剂SABC37℃湿盒内孵育 20min；

（12）0. 01M PBS （pH = 7. 4）洗 5min×4 次；

（13） DAB显色：室温显色，镜下控制反应时间，1 ~ 4min蒸馏水中止反应，蒸馏水洗；

（14）50%酒精~ 60%酒精~ 70%酒精~ 85%酒精~ 95%酒精I，Ⅱ~ 100%酒精I，Ⅱ梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1. 6. 5 计算机图像分析

随机选取 5 张心脏和背根神经节CGRP免疫组化阳性反应切片，在同一放大倍数下，每张切片在光镜下随机选 5 个视野，每组共测 25 个视野。应用计算机图像分析系统进行图像采集、图像处理，分别测定每个视野的背景和CGRP免疫反应阳性神经元数量、表达面积、平均光密度，最后结果以阳性部位的数值与背景数值的差表示，以减少不同批次染色差异对结果的影响。

1. 6. 6 背根神经节CGRP mRNA表达（荧光定量RT-PCR法）

1. 6. 6. 1 大鼠背根神经节总RNA抽提（异硫氰酸胍法）

大鼠背根神经节液氮研磨，加入 1ml Trizol抽提试剂；加入 200μl氯仿/异戊醇（24：1），振荡混匀 30 s，放置 5min；用高速冷冻离心机，12000 rpm， 4℃离心 10min；将上清液小心转移到RNase-free1. 5ml离心管里，加入与上清等体积的异丙醇 1. 0μl的糖原，室温下放置 5min；用高速冷冻离心机，12000 rpm， 4℃离心 8min；小心移去上清液，用70%酒精洗涤两次，每次 700μl， 12000 rpm，分别室温离心 2min和5min；尽可能彻底吸走上清，室温下将酒精空干；沉淀用 20μl DEPC H ₂ O溶解。主要试剂均来自大连TakaRa公司。

1. 6. 6. 2 去除基因组DNA

在RNA酶抑制剂保护下，用DNA酶消解基因组DNA。反应体系20μl。其中含 40 U/μl Rnasin 0. 5μl， 5 U/μl DnaseI0. 5μl， 10×DNase buffer1μl， RNA 9. 5μl。反应程序：37℃30min， 95℃ 5min。

1. 6. 6. 3 逆转录

采用Promega公司提供的反转录试剂盒。去除基因组DNA后立即冰浴 5min；加入 40μl反应体系中，该体系含 5×RTase buffer4 ul， RNasin （RNA酶抑制剂）0. 5 ul， 10mM dNTP 2 ul， Random Primer （25 pmol） 1μl， 100 U/μl RTase （逆转录酶）1μl。反应程序：30℃10min，42℃1h， 90℃，15min。 4℃保存。

1. 6. 6. 4 实时荧光定量聚合酶链式反应

根据GenBank进行引物设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 CGRP和GAPDH （内参基因）引物序列和扩增片段分别为：CGRP （5忆~ 3忆），上游GGA GCA GGA GGA GGA ACA GG，下游CTT CAG AGC CCA CAT TGG TG，扩增片段长度为 161 bp； GAPGH （5忆~3忆），上游TGC TGA GTA TGT CGT GGA GTC，下游TGC TGA CAA TCT TGA GGG AG，扩增片段长度为 173 bp。 EvaGreen是一种可与双链DNA小沟结合的染料。当特异的扩增产物形成双链DNA时， EvaGreen与双链DNA小沟结合，其荧光大大增强，随着DNA的解链，荧光信号迅速减弱。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此，EvaGreen的灵敏度很高。通过解链曲线分析可以确认扩增产物的均一性和有无污染。

标准品制备：以大鼠背根神经节RNA为模板，以GAPDH引物为引物进行RT-PCR扩增， PCR产物经过纯化后，核酸蛋白分析仪测定含量，根据DNATool5. 1 计算每μl的copies数；

Real-time PCR：反应体系 25μl，其中含 5 ×RT-PCR Buffer5. 0μl，250 mMMg ²⁺ 0. 3μl， 10 mM dNTP 0. 75μl， 10μM上游引物 0. 5μl， 10μM下游引物 0. 5μl， 25×EvaGreen1. 0μl， 10 ^-3 ×Calibration1. 0μl， 5 U/μl HS-Ex - Taq0. 25μl， ddH ₂ O 14. 7μl，模板（ cDNA） 1. 0μl。反应程序：95℃ 90 s， 95℃，5 s， 58℃ 30 s， 83℃ 10 s，第 2 步和第 3 步循环 40次。每个循环在 56℃监测荧光信号的强度。主要试剂均来自大连TakaRa公司。

1. 6. 6. 5 反应产物的检测与定量分析

循环阈值（Cycle threshold， Ct）是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系， Ct越大，起始模板的拷贝数越小。本实验中，当CGRP和GAPDH基因拷贝数在 10 ² ~ 10 ⁷ 范围内，循环阈值（Ct）与拷贝数的对数之间呈线性关系，回归分析显示两者之间的相关系数r = 0. 99，见图 2-4，图 2-5。根据标准曲线由Ct值获得起始基因拷贝数的对数，用 10 ⁵ 内参基因GAPDH拷贝数校正结果，结果以基因拷贝数的对数表示。