1.6 实验方法

1. 6. 1 石蜡切片的制备

心脏组织常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制作石蜡切片。具体步骤为：

（1）取大鼠心脏；

（2）将标本置于 4%多聚甲醛缓冲盐溶液中后固定 24h；

（3）用PBS （0. 01 M、 pH = 7. 4）充分洗涤，并修整组织块；

（4）酒精梯度脱水；

（5）二甲苯透明；

（6）浸蜡（石蜡熔点为 58℃）；

（7）石蜡包埋；

（8）切片，每个石蜡块切片 20 张，切片厚度为 5μml；

（9）切片贴于载玻片上，入 37℃温箱过夜，使切片紧贴玻片。

1. 6. 2 HE染色

心脏组织切片脱蜡至水，浸入苏木精染液中，5min。水洗，快速放入 1%盐酸中分化 3 ~ 4s，水洗。镜检，观察细胞核染色情况。水洗后的切片在伊红染液中浸泡 3min。脱水，透明，中性树胶封片。具体过程如下：

脱蜡：二甲苯，10min，二甲苯Ⅱ，5min；

水化：100%酒精I，5min， 100%酒精Ⅱ，5min， 95%酒精I，5min， 95%酒精Ⅱ，5min， 85%酒精，3min， 75%酒精，2min，蒸馏水洗，1min；

染色：苏木精染色，5min，自来水洗；

分化：盐酸酒精分化，3 ~ 4s，自来水洗，镜检；

水洗：自来水洗，15min，蒸馏水洗 2min， 75%酒精，2min， 85%酒精，2min， 95%酒精，2min；

染色：0. 5%伊红酒精溶液染色，1min；

脱水：95%酒精I，5min， 95%酒精Ⅱ，5min， 100%酒精I，5min， 100%酒精Ⅱ，5min；

透明：二甲苯I，5min，二甲苯Ⅱ，5min；

封片：中性树胶封片。

1. 6. 3 血清和心肌乳酸浓度的测定

乳酸测定原理：以NAD ⁺ 为氢受体， LDH （乳酸脱氢酶）催化乳酸脱氢，生成丙酮酸，使NAD ⁺ 转化成NADH。其中PMS递氢使NBT还原为紫色显色物，显色物的吸光度在 530 nm时与乳酸含量成线性关系。血液抽取后立即离心，-20℃保存。组织中乳酸测定需要通过制备组织匀浆后，取上清液，根据浓度适当稀释。试剂盒由南京建成生物工程公司提供。

1. 6. 4 组织蛋白含量测定（考马斯亮兰法）

基本原理：蛋白质分子具有NH ₃ ⁺ 基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入含蛋白的液体中时，考马斯亮兰染料阴离子与蛋白-NH ₃ ⁺ 结合，使溶液变成蓝色，通过测定吸光度可计算蛋白含量。试剂盒由南京建成生物工程公司提供。本次实验中样本先制成 10%的组织匀浆液，然后再稀释成 2%的组织匀浆液作为反应液。（表 1-3，表 1-4）

乳酸含量计算公式：

组织蛋白含量计算公式： G222R/PipyeC80+nTTSa2D9luPPoF996s1vniL2TnB8TpiDoVVTWVub1Y2l/fnpy