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1.2 鳙遗传改良研究

1.2.1 群体选育

群体选育是经典的遗传育种方法,也是许多品种选育方法的基础。根据育种目标,在现有品种或育种材料内出现的自然变异类型中,经比较鉴定,并通过多种选择方法选优去劣,从而选出优良的变异个体(张天时等,2019)。具体来说,研究者从原始群体中选择具有目标性状的个体(如头长、背厚、体高等)并对其编号标记,将其特点记录存档,以备对其后代进行跟踪检测。经过一段时间的培育,研究者再对所选对象进行复选,确认优良性状的稳定性,然后将选定的个体进行专池培育,并根据性状进行配组,完成一代繁殖。在目标性状表现明显的各个生长发育时期,研究者对每一对亲本的F 1 代进行仔细观察测定、严格优选和复选,保留几个、几十个甚至更多优良个体,使其成为具有优良性状的群体。个体经过数代选育后,入选的个体在目标性状上表现整齐一致,则目标品系初步形成。在形成品系的整个过程中工作量较大,需要逐代跟踪检测目标性状和优选个体。品系稳定遗传以后,经过大群体繁殖,参加对比试验,对个别表现优异但尚有分离的个体可继续对其进行选择,以后仍参加优良个体性状的选择(胡银茂,2006)。我国古代劳动人民使用表型选择等典型群体选育方法驯化和培育了一大批家养动物和养殖品种,许多鱼类新品种也是基于群体选育方法而获得的。

尽管群体选育在育种实践中具有巨大的创造性作用,但群体选育只能从现有品种群体中分离出最好的基因型或对现有品种和群体的个别性状进行改良,而不能有目的地创造或产生新的基因型。同时,群体选择不考虑选留个体的亲缘关系,难以平衡亲本(或家系)在子代群体中的贡献率,选择进程中容易造成有效群体降低,从而导致选育后期面临近交衰退的风险(Gjedrem,2005)。因此,该方法具有一定的局限性。尽管如此,群体选育仍作为常规选育的基础方法,通过对目标性状表型数据进行逐代选留,在许多条件下可获得较快的遗传进展。目前,我国的水产优良新品种中有相当比例是以群体选育方法综合培育而来的。对于一些世代周期不长的水产生物来说,选择育种的效果直观可见,其效率也较高。此外,如果将群体选育与杂交育种或现代育种方法如细胞工程育种、分子标记辅助育种等相结合,在许多水产养殖生物中都会产生良好的选育效果(Gjedrem等,2012)。

鳙具有个体大、繁殖周期长、产卵量大等特点,开展群体选育需要长期且大量的经费投入,且选育进程较缓慢。朱文彬等(2020)在对鳙早期生长性状遗传参数估算中发现,鳙30日龄体重和体长的遗传力分别为0.47和0.49,具有较大的选育空间;考虑到亲本对子代贡献率的不平衡现象,长期开展群体选育有可能导致有效亲本数量降低,进而导致近交系数上升,影响选育效果。因此,群体选育需要与其他选育技术结合。针对鳙的成活率、生长速度、品质、抗病性、头的大小等数量性状进行改良,须经过长期连续的定向选择才能达到选择目标。通过定向选择,针对某种质量或数量性状进行系统选育,积累有利的突变基因,选择有益的变异性状,才能尽可能缩短选育周期或减少选育工作量,从而显著改变原始群体的面貌,进而选育出新的品种。

1.2.2 家系选育

家系选育通常指人们在尽可能一致的环境条件下建立若干个家系,并对家系进行比较和测量观察,以家系为单位进行选择,将具有目标性状和优势性状的个体挑选出来作为亲本进行选育,逐代选择表现良好的个体(李学军等,2016)。近年来,家系选育因其系谱清晰、可延缓近交衰退和缩短育种年限、选育效果好并可为分子育种奠定基础等优点而受到广泛关注。家系选育实际是对基因型的选择。通过对优势基因型的富集,选育出的目标性状相关基因具较高的纯合度(楼允东,1999)。正确把握好近亲交配和品系的建立是家系选育的关键。一个近亲繁殖群体,如果不经选择,后代群体中的显性基因和隐性基因数目的比例并不会改变。但是,通过一对一交配建立家系,累积繁殖,使一些隐性基因纯合体出现的百分率增加,从而增加隐性性状的表现概率,这样可以加速淘汰一些不良基因,大大增加了优良性状相关基因的累积频率,最终获得优良的经济性状,这种家系就可称为纯系或纯种(孙效文,2010)。

为了使不同家系的遗传性状更具可比性,研究者要在尽可能相同的条件下进行家系选育,包括:不同家系亲本的交配产卵或人工授精的时间尽可能相同;放养鱼种的大小尽可能一致;各家系单养时,养殖鱼塘或水体的大小尽可能一致,并保证有一定数量的重复试验。研究者最好用不同的标记方法(如电子标记、荧光标记和分子标记等)对不同家系标记后进行同塘混养,最大限度减少因养殖条件不同造成不同家系间的差异。由于家系选育牵涉的家系数一般都比较多,各家系之间不允许有混杂,因此选育时要建立系谱档案,以便能根据资料进行分析研究,得出可靠结论(范兆廷,2005)。国内外利用家系选育已经获得了许多比较好的结果,如对大西洋鲑20个家系中二倍体和三倍体的生长性状进行比较,结果表明,二倍体家系的平均体重显著高于三倍体(Friars等,2001);对尼罗罗非鱼“吉富”品系63个全同胞家系进行研究,加性遗传方差显示“吉富”罗非鱼仍有较大选育价值(Ponzoni等,2005);于飞等(2008)对大菱鲆31个家系进行选育,从中选出1号、6号、26号3个家系的生长速度显著高于其他家系;韦信键等(2013)对大黄鱼32个家系1~6月龄的生长性能进行比较,筛选出3个快速生长家系。朱文彬等(2020)基于亲子鉴定的系谱关系对鳙各繁殖组内家系间生长性状进行方差分析,结果表明,2个繁殖组内家系间生长性状存在极显著差异;多重比较结果显示,部分家系间生长性状存在显著差异,具有实施家系选育的潜力。

家系选育中育种值的估算手段通常包括最佳线性无偏预测法(beset linear unbiased prediction,BLUP)、约束最大似然法和贝叶斯法等。通过估算育种值,可对选择效应进行有效预测。BLUP法的原理就是将对观测值有影响的遗传效应(基因型、系谱信息等)、固定效应(池塘、性别等)和随机效应之和表示为观测值,称之为线性模型。结合子代和亲本的家系信息,BLUP法能显著提高估计育种值的准确性,避免育种值和环境分开导致的偏倚,从而获得真实的育种值(黎火金,2013)。如福瑞鲤2号是采用BLUP育种和家系育种相结合的方法经过5代选育而成的新品种,选育的每一代都比对照组的生长指标有显著提高,其中F 5 代的体重比对照组高19.5%(董在杰,2018)。约束最大似然法在鱼类家系选育中应用也较广泛,如田永胜等(2009)和马爱军等(2012)分别对牙鲆和虹鳟的不同家系进行了生长性状遗传参数估计。在方差估计中,该方法估计值的准确度比较高,但是在计算中要求的样本容量很大,这在一定程度上增加了运算的复杂程度。随着现代计算机技术的迅速发展,在家系选择育种中,经常将约束最大似然法和最佳线性无偏预测法等方法结合在一起使用,进而增加遗传参数的有效性(杨泽明等,2001)。贝叶斯法是同经典参数估计相对应的另一种方法,非常适合非线性模型中遗传参数的估计。该方法通常与其他方法相结合用于鱼类家系选育分析。姜再胜(2014)采用贝叶斯法估算不同家系虹鳟的遗传参数,得出虹鳟对鱼传染性造血器官传染病抗病力的遗传力约为0.34。朱文彬等(2020)研究发现,鳙早期生长性状与其BLUP育种值存在极显著正相关,决定系数介于0.61~0.68,认为通过表型选择在一定程度上也能获得有效的育种效果。

1.2.3 分子标记辅助选育

目前,在鳙的种质保护和遗传选育中,由于其具有个体较大、生长周期长等特点,采用传统的家系选育方法通常需占据较大空间,且管理强度和人力、物力相对较大。因此,育种学家尝试利用现代分子标记来开展亲子鉴定,建立选育的系谱关系,如微卫星标记、mtDNA序列和SNP等。基于这些分子标记对鳙的群体遗传变异(张敏莹等,2013)、亲子鉴定(张丹等,2019)、遗传连锁图谱(Zhu等,2015)和QTL定位信息(Liu等,2016)等进行研究,为其种质改良和育种设计提供更多数据参考和辅助手段。

分子标记辅助选育(molecular assisted selection,MAS)是随着分子生物技术的出现,尤其是PCR技术的发明和广泛应用发展出来的育种辅助技术。通常分子标记指的是DNA标记,主要是SSR和SNP,近年来也包括一些性别特异性标记等。这些流行的DNA遗传标记,与过去的生化遗传标记以及早期的RAPD等遗传标记相比,具有稳定、可靠、灵敏度高及可实现高通量化等特点。基于功能基因的SNP或SSR标记,又比非编码区的上述DNA遗传标记具有更大优势,因为这些与某个性状紧密关联的遗传标记直接与基因功能挂钩,对于解释性状的遗传基础和调控机制有很大帮助(童金苟和孙效文,2014)。分子标记辅助选育主要是通过分子标记对目标性状的基因型进行选择,能够排除非等位基因间的互作和环境因子的影响,具有准确性高、高效、经济等优点。利用分子标记辅助育种,首先要满足筛选的分子标记与目标基因之间紧密连锁,遗传距离最好小于1 cM;其次标记的重复性和适用性要强,并且能高效地在多数个体检测(鲁翠云等,2019)。目前,已经开发出很多分子标记,被用于辅助育种、图谱构建和基因定位等研究。DNA分子标记的种类很多,包括基于DNA杂交的RFLP分子标记,基于PCR的STS、SCAR、SSR分子标记,基于随机引物的PCR分子标记(如ISSR、RAPD),基于限制性酶切技术和PCR结合的DNA分子标记(如AFLP、CAPS等),以及基于测序技术的新型DNA分子标记(如SNP、EST)。现阶段,多数研究以PCR产物的电泳检测SSR分型标记及高通量测序或芯片检测分型的SNP为主。鱼类等水产动物的生长、抗病和抗寒等重要经济性状都是由多基因数量性状基因(QTL)控制的,因此如果能够找到与这些重要经济性状相联系的分子标记,就有可能大大增强选种、育种的目的性和预测性,提高选育养殖品系的效率(鲁翠云等,2019)。

近年来,学者们以鳙为研究对象,通过候选基因或分子标记手段对亲本选择、图谱构建及生长体型等性状开展了一系列的研究。张立楠等(2011)为提高图谱质量,采用新开发的微卫星标记加密了鲢、鳙杂种亲本连锁图,其中雌性亲本鳙的连锁图标记数从153个增加到288个,雄性亲本鲢的连锁图标记数从271个增加到511个;用鲢、鳙图谱共线性比较甄别出22个同源连锁群,且标记排列只存在轻微的重排现象。与模拟自然受精(种内杂种)相比,混精受精(种间杂种)可增加雄性亲本基因组范围的重组率,由此推测混精受精回避了精子竞争、强化了全基因组重排,不利于新形成的和已有的优良单倍型的保留,是鲢、鳙养殖性能退化的原因之一。Wang等(2013)采用拟测交策略,以长江流域野生鳙(♀)和野生鲢(♂)为亲本,对176个F 1 个体进行作图,采用882对SSR引物对群体进行基因分型,筛选到297个多态性标记,用于构建鲢、鳙性别平均连锁图谱、鲢雄性连锁图谱和鳙雌性连锁图谱。结果表明,鲢、鳙性别平均连锁图谱共定位247个微卫星标记,分布于25个连锁群(包括2个三联体和2个连锁对);鳙雌性连锁图谱共定位180个微卫星标记,分布于30个连锁群中(4个三联体和9个连锁对)。随后,作者进一步利用构建的鲢、鳙性别平均连锁图对鲢、鳙杂种的体重、体长、体高、体厚、头长、头高、腹棱长、胸鳍长、腹鳍长、尾鳍长和胸鳍到腹鳍之间的距离总共11个重要形态性状进行了QTL定位分析,发现11个QTL被定位到鲢、鳙性别平均连锁图谱的总共6个连锁群上,每个形态性状定位的QTL数目在1~6个之间,单个QTL的方差解释度为9.1%~23.8%(王军,2013)。这些研究结果为推动鲢、鳙分子遗传育种工作奠定了基础。此外,Liu等(2016)使用905个SSR分子标记对鳙F 1 代进行图谱绘制和QTL定位,共定位到24个连锁群上,图谱总长度为1 630.7 cM,平均标记间隔1.8 cM,比Zhu等(2014)的图谱密度有进一步的提高,并且将鳙体长、体高、头长和体重4个数量性状定位到LG9和LG17 上,表型方差解释度为18.6%~25.5%。

SNP因具有数量位点多、分布广和遗传多样性高等特点,是目前较为主流的分子遗传标记,广泛应用于水生动物抗病、生长、性别鉴定等方面。Liu等(2012)克隆鉴定了鳙转化生长因子(MSTN)基因,并发现了2个SNP,即位于内含子2 上的g. 1668 T>C和3′UTR的g. 2770 C>A,关联分析表明,g. 2770 C>A的基因型与全长、体长和体重呈显著相关。Wang等(2016)发现载脂蛋白(ApoA-Ib)基因的2个SNP对鳙的体重、体长等生长性状均有显著影响。Liu等(2016)在鳙生长QTL分析中定位到TP53BP2 基因以后,进一步发现该基因外显子中的1个SNP与鳙的体重、体长、体高和头长显著相关。Fu等(2016)以鳙野生群体体外杂交构建了117个全同胞子代作为作图群体,3 121个SNP分子标记被分配到24个连锁群上,图谱总长度为234 cM,平均标记间隔为1.27 cM(平均0.75 cM),与前面几位研究者相比,在标记密度上有了很大的提高,并且将与生长相关的性状定位到第3、第11和第15 等6个连锁群上。

全基因组关联分析(genome-wide association studies,GWAS)具有标记多、可以全基因组范围仔细筛查与性状相关变异位点的优点,更易获得基因所在区域,也就更有可能获得决定性状的基因(朱文,2018)。因此,该方法出现后,尤其是在二代测序技术使测序费用大幅降低后,很多生物学领域包括基础研究投入较少的水产动物遗传育种领域也很快开展了此项研究,如Houston、孙效文和刘占江等所在团队分别建立了安大略鳟、鲤和斑点叉尾!的高通量SNP芯片作为开展GWAS研究的平台(Dupont等,2009;Houston等,2014;Xu等,2014)。陈松林等(2018)建立了一种基于全基因组选择的鱼类抗病技术,包振民等(2017)建立了基于全基因组分型技术的贝类选择育种技术,王志勇等(2020)建立了大黄鱼基因组选择育种研究方案,等等。在鳙的相关研究中,Zhou等(2021)利用776个鳙个体和高通量SNP基因分型技术进行GWAS分析,以确定与头部尺寸和头型性状(如头长、头宽、头高、头长/头高、头长/头宽、头长/体长)可能相关的基因组区域和候选基因。结果表明,这些性状中大部分形态测量都呈明显相关性,GWAS检测到11个极显著SNP和12个显著SNP与鳙头部尺寸有关,且这些SNP主要位于连锁图谱LG16 上,其中4个SNP在3个头部尺寸性状中普遍存在。在头长方面,4个极显著和3个显著性SNP位于LG16;对于头宽,5个极显著和4个显著性SNP分别在LG3、LG16和LG21 上被鉴定;对于头高,在LG11和LG16 上检测到2个极显著和5个显著性SNP;在头型方面,17个SNP和6个SNP分别与头长/头高和头长/头宽显著相关,并从这些SNP周围的鳙基因组区域发现了潜在的候选基因,包括 ptch1 col9a1a tgfbr2 hecw2a zbtb42 sema7a 。以上研究结果揭示了鱼类头部尺寸/形状性状的遗传结构,并有助于确定候选基因,以便在未来培育头部更大的鳙时进行分子标记辅助选择。

1.2.4 雌核发育

雌核发育是一种特殊的生殖方式,通常指成熟卵子经精子激活产生只具有母系遗传物质个体的有性生殖方式。雌核发育的鱼类没有减数分裂卵子,即卵子和一般的两性生殖鱼类的单倍体卵子不同,染色体数目和体细胞的染色体数相同;外源精子进入卵子后,仅起到激活和诱导作用,精核一般不与雌性原核融合,而是在胚胎发育过程中逐渐被排斥,从而发育产生的后代与母本相似(曲木等,2019)。雌核发育包含天然和人工诱导两种方式,墨西哥湾流域的亚马孙花鳉( Poecilia formosa )是迄今发现最早的天然雌核发育鱼类,之后在银鲫和花鳉属的一些种类里也有发现,其中异育银鲫( Carassius auratus gibelio )是天然雌核发育最具代表性的例子(吴仲庆,1991)。人工诱导是指采用物理、化学或生物方法,使精子的遗传物质失活,再以这种精子激活卵子,但精子不参与合子核的形成,卵子仅依靠雌核发育成胚胎(范兆廷和寮苏祥,1993)。在国内,雌核发育技术已应用于鱼类、贝类等多种水产经济动物的繁育中。雌核发育技术在快速建立纯系、性别控制和单性群体利用、确定性别遗传机制、基因定位和提高选种效率等方面具有独特的优势和应用价值(曲木等,2019)。

目前,针对鳙的雌核发育工作也陆续展开。严斌(2010)对普通鳙、红鳙和雌核发育红鳙3个种群的生物学特征和遗传多样性进行了分析,在红鳙和雌核发育红鳙的mtDNA基因组全序列测序中发现两种红鳙的基因组序列完全相同,全长均为16 619 bp;其碱基比例:A=31.64%,G=15.94%,T=25.32%,C=27.10%,A+T=56.96%,说明了线粒体严格的母性遗传现象。童金苟团队在前期进行微卫星(SSR)标记—着丝粒作图中发现,根据1代减数分裂雌核发育着丝粒作图估算的固定系数(F),鳙F=0.60,远高于其他一些经济鱼类(大黄鱼F=0.414,大菱鲆F=0.425,胡子鲶F=0.355,日本鳗鲡F=0.357),意味着鳙雌核发育的纯化效果比许多经济鱼类为高(Zhu等,2013)。进一步采用两代雌核发育的策略发现,雌核发育不仅可大大加快鳙遗传同质性的步伐,达到快速驯化的目的;而且可固定对目标性状有利的基因,淘汰对生长等性状不利的隐性基因,这对性成熟周期较长的鳙等的育种工作意义更大(Pang等,2022)。

1.2.5 多倍体选育

多倍体育种技术就是通过增加染色体组的方法来改造生物的遗传基础,从而培育出符合人们需要的优良品种。我国自20 世纪70年代中期开始鱼类多倍体育种工作以来,迄今已获得草鱼、鲤、鲢、虹鳟、鳙、鲫、大鳞副泥鳅、牙鲆等20 余种鱼类的三倍体或四倍体实验鱼,其中三倍体的异育银鲫、湘云鲫、湘云鲤已进入生产养殖阶段(王延晖,2017)。目前,鱼类多倍体的诱导方法主要包括生物、物理和化学方法。生物方法的有效途径包括远缘杂交、核移植和细胞融合。现阶段,通过杂交尤其是种间杂交是培育多倍体的主要手段。Rasch等(1965)最早发现以草鱼为母本、鳙为父本进行杂交所得的F 1 全部为三倍体(3n=72),这一发现开启了远缘杂交产生鱼类多倍体的大门。物理方法是利用物理手段抑制鱼类受精卵正常分裂而获得多倍体后代的方法。常用的物理手段包括温度休克法(冷休克和热休克)、静水压法、高盐高碱法等(朱传忠和邹桂伟,2004)。化学方法是利用化学诱导剂抑制鱼类受精卵正常分裂而产生多倍体后代的方法。常用的化学诱导剂包括细胞松弛素B(CB)、聚乙二醇(PEG)、6 二甲基氨基嘌呤(6 DMAP)、秋水仙素、咖啡碱等。这些药物通过阻止分裂沟形成、抑制细胞质的分裂,阻止了极体的释放而形成多倍体(孙远东等,2008)。

多倍体育种方法简单、技术可行、易于操作。多倍体鱼类对改善品质、加快生长速度、延长寿命、提高产量、控制过度繁殖、保持物种多样性、培育新品种等方面都具有重要意义,应用于水产养殖可以带来巨大的经济效益。但是,多倍体育种仍存在一些问题,如多倍体的繁殖调控机制复杂、三倍体不育具一定相对性、人工诱导多倍体产生的时间和刺激强度难以掌握、四倍体的诱导方法需不断改进和完善等,制约了该技术在生产上的大规模应用(陈乘,2014)。因此,多倍体育种应与性别控制、选育等技术结合,并深入解析多倍体形成的相关机制,进而培育出性状稳定的高品质新品种。 FBp+Qbi9Vd6HnwFXryp+GX2LnDi4MUnrVGdjBXKMkbUk/3BTCYgu9jBYJJGsHrcP

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