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为编纂《本草纲目》，李时珍开启了前后30多年的艰苦工作。
首先是读万卷书。李时珍查阅了800多本古医书，包括最早的药学专著《神农本草经》《本草拾遗》等，归纳总结所有书中合理的部分，剔除其中的谬误之处，做到既继承又发扬。李时珍博览群书，旁征博引，并不拘泥于医学著作，而是试图从各种资料中寻找自己需要的线索，甚至从屈原等人的诗中获得灵感，最终达到准确区分不同药材的目的。
其次是行万里路。令李时珍最头疼的是，不同古书中前后矛盾的内容无法辨别真伪。在父亲启发下，李时珍意识到“纸上得来终觉浅，绝知此事要躬行”。书是静态的，观察是动态的，书中知识有限，只有眼观耳闻才能补其不足。李时珍在徒弟和儿子的陪同下开始了漫长的药物考察历程，走遍祖国名山大川，足迹遍及湖北、湖南、江苏、安徽、江西和广东等地。李时珍遍访民间名医，向他们虚心请教中医药的相关知识，他还四处搜寻民间处方，观察和收集药物标本。每到一处，都会谦卑地向当地人求助，他们中有采药的、种田的、捕鱼的、砍柴的和狩猎的，李时珍从而得到书本中没有的大量知识，比如通过种菜老农的介绍和实物观察，李时珍学会了如何真正辨别几种药用蔬菜的真伪。
李时珍在走访过程中非常注意观察药物的形状和生长环境，有时为了获取第一手材料还常常会冒着生命危险，比如不畏风险近距离观察毒蛇的形状，这样可以在后来的《本草纲目》中精准描述出这种蛇的外观。这样的事情比比皆是，毕竟部分药物生长在人迹罕至之地，未知风险随时都会发生。通过这样操作，他最终修改和纠正了古书中关于药材的诸多错误。
最后是持之以恒。在完成书本知识整理和野外考察资料收集的同时，李时珍迎来最大挑战，那就是正式开始写书。李时珍编纂《本草纲目》是个人行为，并非官方组织的共同编纂，因此任何事都要亲力亲为，不存在分工协作的可能，难度可想而知。更重要的是除了文字，还要配备大量图片，在没有照相机的时代，全靠记忆和手绘，李时珍并非专业画家，个中艰辛和不易可想而知。他的计划是尽可能做到图文并茂，因为有时候单纯的文字叙述会让人产生主观偏见，容易引起误解，甚至以讹传讹，辅之以图片就会客观和准确许多。但此举方便了他人，却给自己增加了巨大的工作量。
本草纲目部分原文
1578年，也就是万历（明神宗朱翊钧年号）六年，时年61岁的李时珍终于完成《本草纲目》的初稿。当书稿完毕，李时珍走出书房时，朋友看到他的第一反应是他消瘦了太多，可谓“为伊消得人憔悴，衣冠不整下堂来”。然而，李时珍对初稿仍不满意，在随后的10年间又进行了三次大修改，直到1588年才正式编订完成。
然而，更大的挑战接踵而来，那就是文稿的出版。李时珍来到南京，试图说服一家官方印刷商出版《本草纲目》，遗憾的是遭到拒绝。随后，李时珍来到江苏太仓拜访自己的老朋友、文坛泰斗王世贞，获得后者写序的承诺。不久，《本草纲目》被一个小的私人印刷厂看重并同意出版，尽管李时珍知道印刷质量会大打折扣，但对一位古稀老人而言，他已没有其他选择。
