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当时细菌致病理论已得到大量的实验支持，而科赫在大学期间跟随亨勒学习时就已初步接受这一观点。要研究肉眼无法直接观察到的细菌，相关工具自然必不可少，妻子的显微镜礼物无疑如虎添翼，成为科赫研究的重要工具。科赫在使用显微镜过程中发现其存在一定弊端，首先是分辨率有限，其次是视野清晰度不高。为此，科赫对显微镜进行适当改进，一方面引入油浸透镜来起到放大作用，另一方面增加聚光镜实现光线聚焦。科赫在显微镜下观察液体中培养的细菌，发现细菌还存在透明、移动的特性，因此难以捕捉和细致观察。科赫采用补充染料使细菌带上颜色而容易被发现；通过在土豆上培养细菌而使其位置固定，这些措施都极大方便了研究。即使到了今天，科赫所改进的显微镜也是普通微生物学实验室的基本工具。
1875年，科赫做了另一件大事。他走访了德国多个科研中心，一方面了解当时的科研动态，另一方面熟悉严格的实验操作程序，以弥补自己“草台班子”式实验室的些许不足。在前期充分准备的基础上，科赫决定主动出击来展示自己的科研才华。他将第一个目标锁定在炭疽，理由是当时炭疽在沃尔斯坦地区的农场中流行，在他到达这里的4年内，该病已导致528人和56000头牲畜死亡。
科学家已发现感染炭疽的动物体内存在细菌，从患病动物脾脏分离出细菌，小鼠接种这种细菌后就会患上炭疽，因此高度怀疑这种细菌为炭疽病因。科赫决定用更全面的数据来证实这一推测。由于经费有限，科赫实验时尽量做到能省则省，就地取材——他的女儿甚至一度担心自己的宠物都会成为爸爸的实验材料。
科赫用死于炭疽病的绵羊血液对小鼠、豚鼠、兔子、狗、青蛙和鸟类等尝试接种，最终一只小鼠患上炭疽并在第二天死亡。通过对死亡小鼠进行尸检，他发现血液、淋巴结和脾脏中存在大量细菌。科赫随后用这只小鼠的血液接种第二只小鼠，也获得了相同结果。通过重复接种，科赫将炭疽繁殖数十代。更为重要的是，科赫使用体外培养的单一细菌进行接种也能造成动物患病。基于这些结果，他认为这些细菌（后称为炭疽杆菌）为致病菌。
科赫发现用充满细菌的液体接种兔子角膜会导致房水
由半透明变混浊，因此房水是炭疽杆菌体外培养技术的理想介质。科赫将一块被炭疽杆菌感染的脾组织放入一滴房水后将其密封在凹形载玻片上，进而创造出了活炭疽杆菌的生长环境，借此观察炭疽杆菌的生命周期。科赫观察到在适宜条件下炭疽杆菌会以长丝状形态繁殖，但在不利条件下会形成球状孢子结构，而在补充营养后这些球状结构会重新出现丝状结构并开始繁殖。科赫随后证明这些孢子和活的炭疽杆菌一样也可致病。这一发现很好地解释了被炭疽杆菌污染的土壤可多年保持致病性的原因——隐匿在沙石和泥土中的炭疽杆菌孢子。基于此，科赫提出减少炭疽传播的基本策略：将患病动物彻底焚烧或掩埋在足够冷的土壤里，以避免孢子形成。
科赫将自己的研究结果寄送给当时德国最著名的植物学和微生物学家费迪南德·科恩，后者兴奋异常，强烈建议将论文发表在他主编的植物学杂志上。在获得科赫同意后，这篇论文最终于1876年刊登。32岁的科赫从一位名不见经传的小人物开始成为一颗冉冉升起的科研新星。
虽然细菌致病理论在此之前已经被提出，但科赫却是第一位将特定细菌与疾病联系起来的科学家。炭疽致病菌的发现具有里程碑式的意义，它标志着细菌学“黄金时代”的到来。